CD4+CD25+Treg细胞的分选\表型鉴定及Foxp3表达鉴定(1)
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【摘要】 目的 为验证从C57BL/6小鼠脾脏中分离出高纯度CD4+CD25+Treg细胞及证实CD4+CD25+Treg细胞中Foxp3基因的表达。方法 使用免疫磁珠分选出CD4+CD25+Treg细胞,流式细胞仪检测纯度;使用TRIZOL抽提Foxp3基因mRNA,使用RT-PCR方法逆转录出Foxp3基因的cDNA。结果 从C57BL/6小鼠脾脏中分离出了纯度达到90%CD4+CD25+Treg。进一步应用RT-PCR技术克隆出Foxp3的cDNA,通过凝胶电泳证实了克隆出了Foxp3的cDNA。结论 使用免疫磁珠方法能够分离出C57BL/6小鼠CD4+CD25+Treg细胞,并进行了Foxp3基因表达的鉴定。
【关键词】免疫磁珠;CD4+CD25+Treg细胞;Foxp3基因
CD4+CD25+Treg cell separate,phenotype identity and Foxp3 gene expression identity
HAN Wen-jie,SHI Yan-xia.Third Department of Oncology,The First People’s Hospital of Shangqiu City,Henan 476100, China
【Abstract】 Objective To confirm high purity CD4+CD25+Treg cells can be separated from the spleen of C57BL/6 mice and Foxp3 gene can be express in CD4+CD25+Treg cells.Methods CD4+CD25+Treg cells are separated with immunomagnetic beads,and purity is detected by flow cytometry.Foxp3 gene mRNA is extracted using TRIZOL.Foxp3 gene cDNA is reverse transcription using RT-PCR technology.Results This study separated CD4+CD25+Treg cell of 90%purity from the spleen of C57BL/6 mice,to advance used technology of RT-PCR to make the clone of Foxp3 gene cDNA,and confirmed it is the cDNA of foxp3.Conclusion This study CD4+CD25+Treg cell can be separated from the spleen of C57BL/6 mice with immunomagnetic beads,and identified foxp3 gene expression.
【Key words】
Immunomagnetic beads;CD4+CD25+Treg cells;Foxp3 gene
肿瘤患者体内的免疫耐受是影响免疫治疗效果的重要原因,肿瘤免疫耐受的产生可能有两方面的原因:①肿瘤本身所产生的IL-10、TGF-β等免疫抑制性细胞因子;②机体自身的免疫抑制状态。免疫抑制性调节细胞是机体实现正常免疫耐受的关键,而这些免疫抑制性调节细胞在肿瘤患者体内的明显增多也是导致肿瘤免疫耐受的关键,其中,CD4+CD25+Treg细胞又被认为是目前所发现的最重要的免疫抑制性调节细胞。
1 材料及方法
1.1 材料 8周龄雌性C57BL/6小鼠由中山大学实验动物中心提供。小鼠CD4+CD25+Treg细胞磁珠分离试剂盒、小鼠CD4-FITC单抗、小鼠CD25-PE单克隆抗体均购自MiltenyiBiotec公司。HRP标记的羊抗小鼠IgG及小鼠mAbIg亚类检测试剂盒均购自Sigma公司。RPMI1640培养基购自Gibco公司。小牛血清购自Gibco公司。羊抗小鼠foxp3 mAb购自eBioscience公司。流式细胞仪为美国BECKMAN-COUTER公司产品。
1.2 分离小鼠脾脏CD4+CD25+Treg细胞 采用颈脱臼法处死C57BL/6小鼠,剪开腹腔,在无菌条件下取出小鼠脾脏。迅速在含有200 U/ml庆大霉素的生理盐水中冲洗2次。在200目滤网上磨碎脾脏,红细胞裂解液裂解红细胞,按照小鼠CD4+CD25+Treg细胞磁珠分离试剂盒说明书进行操作,通过流式细胞仪(BD FACS Calibur)分析获得的CD4+CD25+Treg细胞纯度。
1.3 Foxp3总RNA抽提 取1×106个细胞,根据试剂盒说明书进行操作提取总RNA,将总RNA反转录为cDNA。PCR总反应体系50 μl,循环参数:94℃30 min 预变性,94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,共30个循环,最后以72℃延伸10 min ......
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