大鼠骨骼肌挫伤后骨骼肌肌钙蛋白I mRNA的表达变化(1)
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[摘要] 目的 应用实时荧光定量PCR技术检测大鼠骨骼肌挫伤后肌钙蛋白I mRNA(sTnI mRNA)表达情况，分析其与挫伤的关系。方法 建立大鼠骨骼肌挫伤模型，分别在挫伤后0.5h，1h，6h，12h，18h取材。提取挫伤肌肉中的总RNA，逆转录合成cDNA第一条链，以cDNA作为模板，通过特异性上下游引物荧光定量PCR检测cDNA的拷贝数，选取管家基因核糖体蛋白L32为参比基因，对扩增结果进行相对定量分析。结果 大鼠骨骼肌挫伤后0.5h、1h、6h、12h、18h 的sTnI mRNA表达量分别为正常组的66.7%、46.6%、31.9%、18.5%和15.3%，呈时序性表达下调趋势。结论 大鼠骨骼肌挫伤后0.5h内sTnI mRNA的表达即开始下调，18h内sTnI mRNA的表达有一定的时间规律性，可望作为临床诊断骨骼肌损伤的指标之一。
[关键词] 骨骼肌损伤； 骨骼肌肌钙蛋白I； 实时荧光定量PCR
[中图分类号] R642 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2009)13-40-03
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Expression of sTnI mRNA in Rat Skeletal Muscle after Contusion
ZHANG Lei SUN Junhong LU Jian WANG Yafang WANG Yingyuan
Department of Forensic Pathology，Shanxi Medical University School of Forensic Medicine，Taiyuan 030001
[Abstract] ObjectiveTo investigate the expression of skeletal troponin I mRNA(sTnI mRNA)changes induced by contusion in rat skeletal muscle using Real Time PCR，aimed to provide some help for forensic estimation of wound age. MethodsThe 36 rats were divided into two groups randomly：contusion group(5 subgroups) and control group，the contusion was performed on the right posterior limb of rat. The samples were extractd respectively at 0.5h，1h，6h，12h，18h after contusion. Total RNA were isolated from skeletal muscle of two groups，and reverse transcription polymerase chain reaction was conducted to synthesize the 1-st strand cDNA. With the use of sequence-specific primers，the expression level of sTnI mRNA was studied by Real Time PCR. ResultsOur results normalized by Ribosomal Protein L32(rpL32) showed that mRNA levels of sTnI were 66.7%，46.6%，31.9%，18.5% and 15.3% in contusion groups compared to control group respectively at 0.5h，1h， 6h，12h，18h，which present down-regulated after contusion within 18hs time-orderly. ConclusionThe time-order expression of sTnI mRNA after contusion was potentially indicative for diagnosis of early muscle injury.
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[Key Words]Muscle injury； sTnI mRNA； Real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction
骨骼肌损伤以及骨骼肌疾病在临床上颇为常见，进行快速准确的诊断十分重要。传统酶学指标如CK、CK-MB等并非骨骼肌所特有，且缺乏敏感性和特异性，加之剧烈运动后也可导致血中CK、CK-MB的轻微升高，给骨骼肌损伤，特别是轻微损伤、多发性损伤的早期诊断带来了不小的困难。sTnI与cTnI相似的特性，给骨骼肌损伤以及疾病的诊断提供了新的思路。
本实验拟通过建立大鼠骨骼肌挫伤模型，采用实时荧光定量PCR(Real Time PCR)检测大鼠骨骼肌挫伤后不同时间点骨骼肌肌钙蛋白I mRNA(Skeletal troponin-I mRNA，sTnI mRNA)的表达量，探寻其时序性变化规律，旨在为骨骼肌损伤以及疾病的诊断提供客观依据。
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1 材料与方法
1.1 试剂与主要仪器
总RNA提取试剂盒(SV Total RNA Isolation System)购自美国Promega公司；反转录试剂盒(PrimeScript RT-PCR Kit)及实时荧光定量试剂盒(SYBR Premix Ex Taq)购自大连宝生物工程有限公司；美国Stratagene公司Mx3005P实时荧光定量PCR仪；美国SIGMA公司低温高速离心机2-16PK型。
1.2 实验动物及分组
健康成年清洁级Sprague-Dawley大鼠36只，由山西医科大学实验动物中心提供。雌雄不限，体重(300±15)g，随机分成6组，每组6只，包括5个损伤组(0.5h，1h，6h，12h，18h)和1个正常对照组。
, 百拇医药 1.3 动物模型制作及取材
1.3.1 动物模型制作 经口鼻乙醚麻醉大鼠，选取大鼠右后肢股四头肌作为挫伤着力点，用本室自制的褪毛剂褪净着力点附近约2.5cm×2.5cm区域的鼠毛，仰卧位固定于鼠板上，充分暴露打击区域。利用改进的Marmarou自由落体装置，250g重力锤自150cm高度垂直自由落下，造成大鼠右后肢股四头肌处肌肉挫伤(解剖证实损伤率达100%)。
1.3.2 取材 大鼠存活至预定时间后迅速脱颈处死。打击区域常规手术消毒后，无菌手术剪剪开皮肤及浅层肌肉，暴露股四头肌损伤处，取材并严格称重40mg，将检材包裹好后迅速置于液氮中保存备用。
1.4 总RNA的提取及检测
1.4.1 总RNA的提取 严格按照SV Total RNA Isolation System试剂盒说明进行操作。提取完毕后，取4μL进行紫外分光光度测定，5μL上样电泳检测完整性。, http://www.100md.com