pIRES2-EGFP-hIL-10真核表达载体的构建及鉴定(1)
 |
 |
[摘要] 目的 构建带有报告基因EGFP的hIL-10真核表达载体。方法 通过RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增出IL-10基因,构建IL-10基因和报告基因EGFP基因真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL-10,经PCR、酶切、测序等方法进行鉴定,紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度。结果 酶切、PCR及测序证实pIRES2-EGFP-hIL-10载体序列正确。结论 成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL-10,可为后续器官移植免疫耐受的研究奠定基础。
[关键词] 基因;IL-10基因;真核表达载体;载体构建
[中图分类号] Q754[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701(2009)34-01-03
Construction and Identification of pIRES2-EGFP-hIL-10 Plasmid
, http://www.100md.com
CHEN Lihong1LIU Jingfeng2FANG Hangrong1QIU Minglian2
1.Department of Pathology,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China;2.The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China
[Abstract] Objective To construct the pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid of human. Methods IL-10 gene was amplified from human peripheral blood lymphocytes by using RT-PCR,and then pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid was constructed. The identification was done by using endonuclease cutting,PCR and sequencing and the plasmid concentration and purity were detected by using UV spectrophotometer. Results Endonuclease cutting. PCR andsequencing showed the successful construction of pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid.Conclusion We construct pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid successfully and lay the foundation for immunotolerance researchesin the organ transplantation.
, 百拇医药
[Key words] Gene;IL-10 gene;Eukaryotic expression vector;Vector construction
白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)是最初由Mosman等1989年发现的一种由Th2分泌的细胞因子,它能抑制Thl细胞因子的分泌。近来,越来越多的研究表明IL-10具有抑制免疫活性细胞的激活和细胞因子产生的作用,与移植物排斥有密切关系,因此在器官移植领域,越来越多的研究表明,IL-10能通过多种途径来抑制或减轻排斥反应,从而延长移植物的存活时间。我们通过构建hIL-10真核表达载体为今后在器官移植免疫耐受的进一步实验研究提供依据。
1材料与方法
1.1外周血单核细胞的制备
取正常人新鲜抗凝血5mL与Hanks液等量混匀后,加于4mL淋巴细胞分离液上,离心收集细胞,用5mL含10%的胎牛血清1640CM培养液悬浮,加入25mg/L的ConA,于37℃、5% CO2培养箱中孵育24h。
, 百拇医药
1.2RT-PCR扩增人IL-10基因
淋巴细胞经ConA刺激后,用Trizol试剂按说明书提取总RNA。逆转录体系为:模板RNA溶液5μL,5×RT buffer 4μL,dNTP(各10mmol/L) 混合物2μL,RNA酶抑制剂0.5μL,引物设计参照GenBank上人IL-10基因序列分别设计引物下、下游引物。上游引物:IL-10F:CCGCTCGAG CCACC ATGCACAGC TCAGCACTGCTCT,下游引物:IL-10R:CCGGAATTC TCAGTTT CGTATCTTCATTGTC。Oligo(dT) 引物1μL,AMV返转录酶1μL,DEPC水6.5μL。42℃保温1h,置95℃温育5min 使AMV逆转录酶失活。将此反转录产物直接进行PCR。目的片段大小约540bp。PCR反应条件:94℃预变性2min,94℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸1min,共30个循环,最后72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定(100V,30min),凝胶成像系统摄像。
, 百拇医药
1.3真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL10的构建
1%琼脂糖凝胶电泳分离并回收PCR产物,连同pIRES2 -EGFP空载体,经Xho I和EcoR I 双酶切后,T4 DNA 连接酶4℃过夜连接,连接产物按常规方法转化于DH5a 感受态细胞。挑取单克隆菌落进行扩增培养,采用HiSpeed Plasmid Midi Kit 质粒纯化试剂盒(QIAGEN公司)抽提质粒,详见说明书。
1.4真核表达载体pIRES2-EGFP-hIL10鉴定
1.4.1限制性内切酶酶切、电泳及片段回收取IL-10质粒抽提产物用(CTCGAG CCACC ATG)和(GAATTC TCA)双酶切,反应体系:Xho I 1μL,EcoR I 1μL,10×K Buffer 2μL,重组质粒(118μg/mL)5μL,灭菌双蒸水11μL,反应混合液混匀后置37℃酶切过夜后,1%琼脂糖电泳(100V,30min)凝胶成像仪成像。
, 百拇医药
1.4.2PCR法鉴定hIL-10目的基因片段IL-10基因上游引物:5 ATGC ACAG CTCA GCAC TGCT CT 3,下游: 5 TCAG TTTC GTAT CTTC ATTG TC 3,预期产物大小为450bp。
反应总体积25μL,反应体系如下:10×Buffer 2.5μL,灭菌双蒸水17.375μL, dNTP mixture(各2.5mM)2μL,上游引物(10μM)1μL,下游引物(10μM)1μL,菌液1μL,Taq(5U/μL)0.125μL,总体积25μL。PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共30个循环,最后72℃延伸7min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定(100V,30min),凝胶成像系统摄像。
1.4.3测序取质粒抽提产物1mL,用通用引物送博亚公司测序。, 百拇医药(陈丽红 刘景丰 方航荣 邱明链)