T细胞疫苗诱导异种胰岛移植免疫耐受的实验研究(2)
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1材料与方法
1.1动物
供者为Wistar雄性大鼠,180～200g,由山西医科大学生理教研室提供;受者为BALB/c(H-2d)雄性小鼠,20～25g;由中国医学科学院动物研究所提供。
1.2试剂及药品
胎牛血清(四季青公司);RPMI细胞培养基(HYCLONG);淋巴细胞分离液(TBD);丝裂霉素C(协和发酵工业株式);刀豆蛋白A(Sigma);链脲霉素(Sigma);ficoll400(sigma);胶原酶V(Sigma)。
1.3制备Wistar大鼠和Balb/c小鼠脾脏单个核淋巴细胞悬液
无菌取大鼠脾脏,研磨制成匀浆,Hanks液稀释,200目不锈钢网过滤,制成细胞悬液,10倍细胞压积的比例加入红细胞裂解液,充分吹打混匀后,Hanks液洗两次,轻轻加入到淋巴细胞分离液上层密度梯度离心,收集界面层细胞,即为单个核淋巴细胞,Hanks液洗涤两次,台盼兰拒染法鉴定活细胞数大于95%,RPMI1640培养液调细胞浓度至2×105/mL,丝裂霉素C(25μg/mL)37℃水浴45min灭活细胞,PBS洗涤3次,调细胞浓度至2×105/mL。同样方法制备小鼠脾淋巴细胞悬液,调细胞浓度至2×105/mL,分装于100mL的培养瓶内(5mL/瓶),不行丝裂霉素处理。
1.4制备T细胞疫苗
灭活大鼠脾淋巴细胞5mL接种于小鼠淋巴细胞培养瓶内,混合后加入ConA2.5μg/mL,37℃,95%O2,5%CO2孵箱中培养48h 后收集细胞,然后加入丝裂霉素(25μg/mL)处理灭活细胞(37℃水浴45min),RPMI1640培养液调细胞浓度至1×107/mL,制成供者特异性T淋巴细胞疫苗。
1.5小鼠Ⅰ型糖尿病模型的制备
将链脲霉素(STZ)用0.1mmol/l无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配成2%溶液,调节PH4.5,滤菌器除菌。小鼠过夜禁食12h,按160mg/kg体重一次性腹腔注射STZ溶液,24h内随机测血糖≥16.5mmol/l,稳定一周即可视为造模成功,作为受体 ......
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