BMP-7与IL-6对人髓核细胞ColⅡ与TIMP-1基因表达的影响(2)
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1.2.2实验分组及处理细胞传至第三代且培养细胞达到90%融合时,计数后将其转至六孔培养板,每孔内约有2.5×105个细胞,并换用含12%胎牛血清的DMEM培养液,加入浓度分别为 ①0ng/mL (对照组);②IL-6组100ng/mL;③IL-6加BMP-7组 加入IL-6 100ng/mL同时加入BMP-7 100ng/mL;④IL-6加BMP -7组加入IL-6 100ng/mL同时加入BMP-7 1000ng/mL;⑤BMP-7组加入BMP-7 1000ng/mL,每个浓度三复孔,逐日于倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,共同孵育72h,收集细胞。
1.2.3逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptionnpolyme-rase chain reaction,RT-PCR)采用TaKaRa公司Trizol一步法说明提取各组收集细胞的总RNA,每份样品取1μL稀释至500μL,紫外分光光度仪测纯度与浓度。取1μg 总RNA 用逆转录酶M-MLV进行逆转录,将逆转录产物cDNA模板1μL分别加入到总体积为25μL的反应体系中,混匀,离心,置于PCR仪内扩增,同时取等量cDNA扩增β-actin作为内参(各基因的引物序列及扩增片段见表1)。PCR反应条件:95℃ 2min预变性;然后95℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 45s,共30个循环数;最后总延伸72℃ 10min。PCR产物加样于2% 琼脂糖凝胶进行电泳,紫外光凝胶成像系统扫描PCR 产物条带灰度,以目的基因与β-actin的灰度比值进行半定量统计分析,比值表示目的基因的相对表达水平,比值越大,其表达程度越高。
1.3统计学分析
采用SPSS13.0统计软件处理数据,计量资料用均数±标准差(χ±s)表示,多组间比较采用方差分析,组间两两比较采用t检验,P<0.05为有统计学意义。
2结果
见图1、2 及表2,图3为β-acting。结果显示IL-6组与1、3、4、5组相比有显著差异,P<0.05;说明在椎间盘退变过程中IL-6起到重要作用;1、3组与4、5组相比有显著性差异,P<0 ......
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