三氧化二砷诱导SGC7901细胞凋亡及对bcl-2\cyclin D1表达的影响(2)
 |
| 第1页 |
参见附件(2200KB，3页)。
1.2.2Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率采用流式细胞仪(FCM)Annexin V/PI双染法检测:取对数生长期细胞,以(1×106)个/孔的密度种植于25cm培养瓶,培养48h细胞贴壁后,加三氧化二砷至不同终浓度,孵育48h后收集所有悬浮及贴壁细胞。1000rpm离心3min弃上清,Annexin V-F ITC 结合液重悬细胞,室温避光孵育10min,离心,弃上清,Annexin V-F ITC结合液重悬细胞,PI冰盒中避光孵育10min,随即上机检测。每组检测10000个细胞。
1.2.3逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测bcl-2、cyclin D1基因转录水平取对数生长期细胞,调整细胞浓度为(1×106)个/mL,接种于25cm培养瓶。分组方法为药物干预组和对照组两大组,其中干预组分别加入浓度为1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L的三氧化二砷。培养48h后,分别收集各组细胞,行RT-PCR检测相关基因的表达。
①总RNA提取:以trizol法提取总RNA,1.2%琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计测定A260/A280。确定RNA浓度和纯度,纯度为1.8~2.0。②cDNA 合成:20mL逆转录体系中,含有总RNA1μg,10μM oligo(dT)15 2μL,2.5mMeach dNTP2μL,5×First-Strand Buffer 4μL,0.1M DTT1μL,40U/μLRnase 0.5μL,200 U /μLTIANScript M-MLV 1μL,加ddH2O,至体积20μL。经70℃5min、42℃50min、95℃5min终止反应合成cDNA。③PCR扩增检测bcl-2、cyclin D1基因的表达:PremierPrimer 5设计引物,bcl-2上游引物5’- TTGGATCAGGGAGTTGGAAG- 3’,下游引物5’- TGTCCCTACCAACCAGAAGG-3’,扩增产物295bp;cyclinD1 上游引物5’-CTGGCCAT2GAACTACCTGGA - 3’,下游引物5’-GTCACACTTGATCACTCTGG-3’,扩增产物483bp;β肌动蛋白(β-actin)作内参照,上游引物5’- AAACTGGAACGGTGAAGGTG-3’,下游引物5’-GTGGCTTTT AGGATGGCAAG-3’,扩增产物160bp ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2200KB，3页)。