靶向OPN的miRNA对人肺腺癌细胞株A549顺铂敏感性的影响*(2)
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1 材料与方法
1.1 材料
A549细胞株由本实验室保存,DMEM培养基购自Gibco公司,胎牛血清为杭州四季青公司产品。重组质粒PcDNA6.2-GW/ EmGFP-miR-OPN/Negative、脂质体lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;质粒小提试剂盒购自Promega公司;大肠杆菌菌株One Shot TOP10购自北京全氏金公司;细胞蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天公司。人OPN ELISA试剂盒购自武汉博士德生物科技公司。大观霉素(spectinomycin)、四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品。顺铂购自山东罗欣药业公司。
1.2 方法
1.2.1 miRNA重组质粒的扩增与纯化 -80℃冰箱取出100μL TOP10冰上融化后每100μL加入特异性干扰质粒(miRNA-OPN)和阴性对照质粒(miRNA-negative control)各2μg混匀,冰浴30min。42℃水浴90s,冰上放置1min后加入37℃温育的LB培养基100μL,37℃ 200rpm/min水平振摇1h。各取100μL转化菌涂布于LB/spectinomycin(50μg/mL)固体琼脂平板上,37℃恒温过夜,单个菌落为转化菌落。用灭菌的10μLTip头各挑取3个单克隆菌落接种到LB/ spectinomycin液体培养基中,37℃摇菌过夜,设置不加转化菌的阴性对照。次日收集细菌,按说明书快速提取小量质粒DNA,紫外分光光度计测定质粒浓度和260/280吸光度比值。
1.2.2 肺腺癌细胞株A549细胞培养与转染 对数生长期A549细胞按5×105/孔移至六孔板,细胞80%融合时进行转染。实验分为未转染组、转染组和阴性对照组。未转染组不转染miRNA,转染组转染miRNA-OPN,阴性对照组转染miRNA-negative control,每组三个复孔。按照Lipofectamine 2000说明书操作,4h后更换完全培养基继续培养。
1.2.3 ELISA法检测OPN的表达 细胞转染后48h收集细胞加250μL蛋白裂解液于4℃,30min裂解细胞。BCA法总蛋白定量。取裂解上清液按OPN说明书操作,酶标分析仪测定450nm吸光度(A)值 ......
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