离心分离法与贴壁分离法对培养骨髓间充质干细胞生物学特性影响(2)
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1.4 MSCs传代培养
原代细胞长满单层后,即可进行传代,首先弃去培养液,用CMF-PBS液洗细胞两次后,加入消化液(0.25%胰蛋白酶+0.01% EDTA)约1mL,消化约5min,倒置显微镜下证实细胞已完全分离(此时镜下可见细胞呈圆球形),加入4mL含血清培养基,反复轻轻吹打成单细胞悬液,离心并用无血清培养基洗涤1次后重新加入含血清培养基计数,按所需密度传代培养或冷藏。
1.5 MSCs细胞的HE、Gimas染色及细胞骨架制备
Gimas及HE染色采用文献报道方法,细胞骨架制备按参考文献[2]方法。
1.6 MSCs流式细胞仪观察制样
按文献[2]的方法制备观察样本,用流式细胞光度计(FCM)检测,采用激发波长为488nm的氩离子激光,DNA被PI着色成红色荧光,蛋白质被FITC着色成绿色荧光,打印出各组细胞周期所占百分比,计算增殖指数(proliferation index,PIX)衡量细胞的增殖活性,PIX=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%。两组检测数据用均数±标准差(χ±s)表示,各项指标差异显著性用t 检验。
2 结果
2.1 细胞形态学观察
2.1.1 密度梯度离心法 细胞培养24h后,均可见大圆形细胞与少量小圆形细胞悬浮于培养液中,4d首次换液后可见少量细胞呈短梭形、多角形细胞及三角形,培养到12~14d细胞增殖铺满至80%左右,15~16d细胞增殖逐渐汇合成单层细胞。传代后至第3代时细胞形态较均匀,呈长梭形集落状分布。
2.1.2 贴壁分离法 细胞培养24h后,均可见数目较多的小圆形细胞、血细胞悬浮于培养液中。4d时首次换液后可见到梭形、多角形细胞及三角形的贴壁细胞;第7~ 8天可见这些细胞呈集落样分布;至第10~12天细胞增殖铺满至80%左右,14~15d时增殖逐渐汇合成单层细胞。Gimas 染色可见细胞核为紫红色,圆形或椭圆形,镜下可见分裂相细胞,两种分离方法未见不同 ......
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