人bFGF重组慢病毒转染BMSCs的实验研究(2)
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1.2方法
1.2.1大鼠BMSCs的分离、培养及流式细胞仪表型的鉴定 采用全骨髓法。取体重为80～120gSD大鼠(雌雄不限),腹腔注射水合氯醛(0.3mL/100g),浸泡于75%乙醇中10min,无菌条件取双侧股骨、胫骨,剪断两端,用注射器吸取适量DMEM液冲洗股骨、胫骨骨髓腔,将团块细胞吹匀制成细胞悬液,接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,在37℃、5%CO2饱和湿度环境中培养。3d换液以去除未贴壁的造血干细胞,此后每3～4 天换液1次,待贴壁的成纤维样细胞达到80%融合时,用0.25%胰蛋白酶2～3min,按1∶2～3的比例进行传代培养,并记做第1代,标记为P1,依此类推。经2～3次传代即可获得形态均一的MSCs。取第3代已达融合的细胞,0.25%胰蛋白酶消化制备成单细胞悬液,离心后以100μL流式buffer重悬,每个检测管中加入重悬细胞3×105个,取7管分别加入含CD44PE、CD106PE、CD45PE、CD11bPE、CD34FITC、CD90FITC 单克隆抗体,剩余1管不加任何抗体,作空白对照;避光室温孵育30min,1000r/min离心5min,弃上清,以洗脱未结合上的流式抗体洗涤,加入300μL buffer,混匀送流式细胞仪检测。
1.2.2慢病毒感染BMSCs取处于对数生长期的MSCs进行胰酶消化,制成细胞悬液,将细胞悬液接种于6孔板中,每孔细胞数约为5×104。37℃、5%CO2培养箱培养待细胞融合度达到约30%。根据细胞MOI分别为10,30,50加入5×105,1.5×106,2.5×106量的携带人bFGF和GFP基因的慢病毒(lenti- bFGF-GFP),polybrene至终浓度为5μg/mL 感染MSCs,72h后观察慢病毒上报告基因GFP 的表达情况。于荧光显微镜下观察和拍照,随机选取5个高倍镜视野,拍完荧光照片后,在同一视野下拍白光的细胞照片 ......
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