人bFGF重组慢病毒转染BMSCs的实验研究(3)
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慢病毒载体能感染分裂期及非分裂期细胞,能使目的基因整合至靶细胞基因组从而实现长期表达;转移的基因片段容量大;可向同一细胞引入多种不同的基因,或对同一细胞反复感染;不易诱发宿主免疫反应,其生物安全性也得以大幅提高[11]。bFGF不仅参与神经组织的修复,而且对损伤的神经细胞具有保护作用[12]。脊髓损伤后,蛋白激酶被激活,破坏细胞骨架,造成膜损伤及最终的细胞溶解死亡,而bFGF可防止或抑制细胞内Ca浓度升高,维持Ca稳定,保护神经元免受兴奋性氨基酸的毒性作用[13]。Mocchetti等[14]在大鼠脊髓挫伤模型中检测出bFGF的升高,其变化以伤后4d最明显,表明脊髓损伤后增多的bFGF具有生物学活性。Lee等[15]的研究表明,bFGF比其他神经营养因子的神经保护作用更大,成年鼠脊髓挫伤后,持续髓内灌注bFGF,脊髓的完全及不完全损伤区明显减少,提示bFGF在脊髓损伤方面起非常重要的作用。本实验中,我们用带有GFP和bFGF基因的慢病毒转染培养的大鼠骨髓MSCs,GFP报告基因的表达产物带有天然的荧光,这样无论是体外基因转染或者转染细胞体内移植后,都可以非常直观的利用荧光显微镜观察目的蛋白的表达位置和情况。通过观察转染细胞相应荧光的有无及强弱,即可判断对目的基因的表达情况,而无需繁琐的鉴定。
本实验利用慢病毒载体将bFGF基因导入大鼠MSCs内,以细胞作为bFGF的发生器,经ELISA检测到转染72h后的MSCs内bFGF呈持续高水平表达,与空载体组和空白组比较具有显著统计学意义,而对照组之间无显著统计学意义。RT-PCR检测实验组在mRNA水平的表达情况亦有类似结果:bFGF-GFP -BMSCs组mRNA较对照组显著减少,而2个对照组间比较无明显差别,说明带有目的基因的慢病毒,不论是在mRNA水平还是蛋白质水平都显著提高bFGF的表达 ......
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