TGF-β1受体阻滞剂对树突状细胞融合疫苗制备的影响研究(2)
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1.4融合疫苗的制备[5]
取生长良好的panc02与DC,调节细胞浓度分别为1×107/mL和1×106/mL,将其按panc02∶DC=10∶1混合离心洗涤弃上清,加入1mL PEG(50%,在37℃水浴中预温),轻吹,使两种细胞均匀混合,加入9mL DMEM培养液终止细胞的融合反应,离心洗涤弃上清,在DMEM完全培养液(10%胎牛血清)培养1d,14d后更换HAT培养液,再7d后更换HT培养液,获取纯净的融合细胞。
1.5细胞表型的检测
取未经SB-431542和经SB-431542培养的融合细胞用荧光素标记抗体,流式细胞仪检测其CD80、CD86、CD40的表达。
1.6观察细胞形态
取DC、非SB-431542组和添加SB-431542组,调节细胞浓度分别为2.5×104/mL、1.5×106/mL、1.4×106/mL,接种于6孔板中,5%CO2孵箱中培养7d,观察细胞形态。
1.7淋巴细胞悬液的制备
取C57BL/6小鼠断头处死,取脾脏碾磨过200目滤膜,制成单细胞悬液,再用淋巴细胞分离液分离混合淋巴细胞,DMEM培养液洗2次,5% CO2培养4h,即为效应细胞。
1.8肿瘤细胞的体外杀伤作用
将效应细胞与SB-431542组融合,非SB-431542组按1∶1均匀混合细胞、5%CO2的孵箱静置培养观察3d;培养结束后将细胞浓度调整为2×105/mL,加入含(2×104/孔)的96孔板,5%CO2孵箱静置培养观察2d;每孔加入5mg/mL MTT各40μL,4h后采取一次翻转法弃掉MTT,然后每孔各加入100μL DMSO,将培养板置于微孔板振荡器上振荡10min,使结晶物充分溶解,酶联免疫检测仪测定光吸收值(A),测定波长570nm、参考波长630nm,空白培养液为对照。按下列公式计算各组对panc02的杀伤率。肿瘤细胞抑制率=(对照孔平均A -实验孔平均A)×100%/对照孔平均A
A570-630 =A570-A630
1.9统计学方法
所得数据以均数±标准差(χ±s)表示,采用两组独立样本t检验SPSS13 ......
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