HPLC法测定前列舒乐咀嚼片中淫羊藿苷的含量
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[摘要]目的 建立反相高效液相色谱法测定前列舒乐咀嚼片中淫羊藿苷含量的方法。方法 采用BOS Hypersil C18 ODS2(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，乙腈-水(29：71)为流动相；流速为1 mL/min，检测波长为270nm。按外标法进行检测。结果 淫羊藿苷在浓度为(49.00～147.00)μg/ mL 范围内线性关系良好，r=0.9995(n=5),样品加样平均回收率为99.84%，RSD为0.82%。结论 该方法简便，准确、重复性好、专属性强，可作为前列舒乐咀嚼片的含量测定有效方法。
[关键词] 前列舒乐咀嚼片；高效液相色谱法；淫羊藿苷；含量测定
[中图分类号]R927.2[文献标识码] B [文章编号]1673-9701(2011)19-91-02
前列舒乐咀嚼片具有补肾益气、化瘀通淋的作用，用于肾脾双虚、气滞血瘀、前列腺增生、慢性前列腺炎。原标准中没有含量测定项目，为更好地控制产品质量，我们选用高效液相色谱法对方中主药淫羊藿中淫羊藿苷的含量进行了测定。淫羊藿具有温肾壮阳、强筋骨、祛风湿的功能,有降压、强心、抗心律失常、镇咳、祛痰、平喘、抗炎、抗衰老的作用[1]。淫羊藿含有多种黄酮类成分，能调整机体免疫功能，促进核酸代谢，改善心肾血液循环[2]，其含量测定具有重要意义。结果表明，此方法可行，专属性较好。现报道如下。
1仪器与试药
Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；GB15-DAD二极管阵列检测器；G1314A -VWD可变波长检测器；Agilent化学工作站；Hypersil C18 ODS2色谱柱(250mm×4.6mm， 5μm，大连依利特公司)；UV-1201型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)；BP-211D电子天平(德国赛多利斯公司)；SB3200T超声波清洗器(上海必能信有限公司)。
乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。淫羊藿苷对照品(批号110737-200412，由中国药品生物制品检定所提供，含量测定用)；前列舒乐咀嚼片样品(自制)。
2色谱条件[3]
色谱柱：大连依利特公司Hypersil C18 ODS2色谱柱(250mm×4.6mm5μm)；流动相：乙腈-水(29：71)；检测波长为270nm；流速：1.0mL/min，柱温为室温；进样量10μL。理论板数按淫羊藿苷峰计算不低于4000。
3方法与结果
3.1测定溶液的制备
3.1.1 样品溶液的制备取本品适量，研细，称取0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)45min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.1.2 阴性对照溶液的制备按质量标准中处方比例同法制备不含淫羊藿的阴性样品溶液。
3.1.3 对照品溶液的制备精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.05mg的溶液，即得。
3.2检测波长的选择及空白试验
取上述对照品溶液，用紫外可见分光光度计在波长190～400nm的范围内进行扫描[4]，结果淫羊藿苷对照品溶液的最大吸收波长为270nm。因此确定本含量测定的波长为270nm。
取对照品溶液、阴性对照品溶液和供试品溶液，在上述色谱条件下测定HPLC图谱。淫羊藿苷的分离度较好，阴性样品在相应出峰时间区域没有干扰峰出现，故对样品的测定无干扰作用。
3.3线性关系考察
精密吸取上述对照品储备液各1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取20μL溶液注入色谱仪，记录峰面积。
以浓度y 为纵坐标，峰面积x为横坐标绘制标准曲线，计算，得回归方程y=25.1309+43.0624S,r=0.9995(n=5)结果表明，淫羊藿苷在浓度为(49.00～147.00)μg/ mL范围内，进样浓度与峰面积呈良好的线性关系。
3.4 精密度试验
精密吸取浓度为98.00μg / mL的对照品溶液，连续进样6次，每次进样10μg ，记录峰面积，RSD为0.09%，说明仪器精密度好。
3.5重复性试验
按供试品溶液的制备方法，对同一批样品制备6份供试品溶液，各吸取10μL进行测定，记录峰面积，RSD为1.04%，说明本方法重复性良好。
3.6稳定性实验
取同一批号样品溶液，在室温放置，分别于0、2、4、6、8、10h进样测定，RSD为0.03%，说明本法稳定性良好，能满足测定要求。
3.7回收率试验
采用加样回收率试验， 取已知含量(含量：2.56mg/g)的样品精密称取6份，分别置具塞锥形瓶中，分别加对照品溶液(0.05423mg/ mL)10mL，照供试品溶液制法操作，测定含量，计算加样回收率，6次平均回收率为99.84%，RSD为0.82%。结果表明，该测定方法回收率高，结果准确。见表1。
3.8 样品测定
取样品溶液与对照品溶液，按上述色谱条件进样，记录峰面积，按外标法计算含量，结果见表2。 结果表明本品重复性良好。
4讨论
4.1 提取溶剂的选择[5]
分别以甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯为溶剂对样品进行超声提取，提取液进行HPLC测定。结果表明，乙醇提取液测得色谱峰的峰面积最大，于是选择乙醇为提取溶剂。比较以不同浓度乙醇为溶剂所测的峰面积，结果70%乙醇测得的峰面积最大，且峰形好，故本实验选用70%乙醇进行提取。
4.2 提取方法的选择[6]
分别采用回流提取法和超声提取法进行提取，所得提取液采用HPLC法测定淫羊藿苷色谱峰面积。结果表明，超声提取法测得淫羊藿苷含量较高，且时间较短，无其他组分峰干扰，操作步骤简单，故本实验采用超声提取法进行提取。
4.3 含量限度的确定[7]
样品中淫羊藿苷的平均含量为1.28mg/片，考虑到工艺及药材产地的差异、质量情况与实际生产工艺的稳定性等原因及结合10批样品稳定性考察试验结果 ......
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