冬虫夏草对延缓糖尿病肾病肾小球系膜细胞增殖的研究(2)
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人肾小球系膜细胞需要经过细胞复苏、细胞培养、细胞传代和细胞冻存等步骤，由相差显微镜观察以及间接免疫荧光染色进行鉴定确认后，将制备好的含药血清干预各实验分组，经过药物功能干预后的HMC，应用MTT法检测细胞增殖情况，采用酶标仪在490nm波长处各孔测吸光度(A)值。
1.7 RT-PCR方法检测mRNA的表达
取出细胞培养瓶，倒掉原液，经过将系膜细胞提取总RNA、测定提取的总RNA量、扩增产物的鉴定-琼脂糖凝胶电泳分析：用VILBER LOURMAT型成像系统进行分析，分别测量TGF-β1和β-actin电泳条带的光密度和面积，以TGF-β1、与β-actin比值代表TGF-β1基因mRNA表达水平。
1.8 统计学处理
实验数据用SPSS16.0统计软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差(χ±s)表示，多组间数据比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较方差齐用配对t检验，方差不齐用Dunnett’s检验。以 P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
冬虫夏草及福辛普利药物血清干预后24h和48h后，对高糖培养细胞增殖具有不同程度抑制，在相同作用时间下其各组与正常对照组比较具有统计学意义(P<0.05或P <0.01)；与高糖组比较具有统计学意义(P <0.05或P <0.01)，通过RT-PCR方法检测mRNA的表达，说明正常人肾小球系膜细胞存在TGF-β1 mRNA表达，说明TGF-β1参与是细胞生理活动；通过高糖培养mRNA的表达增加，明显高于正常对照组。说明高糖状态刺激肾小球系膜TGF-β1的表达。见表1、表2。
3 讨论
冬虫夏草是一种名贵的药用真菌，属肉座菌目麦角菌科虫草属植物，为虫草菌的子座与其寄主蝙蝠蛾幼虫尸体的复合物，俗称虫草。随着科学技术的不断进步与发展，近年来冬虫夏草用以治疗DN受到临床和许多学者重视。它含有丰富的蛋白质、多种氨基酸、糖类、醇类、核昔类、维生素、微量元素、有机酸等成分[1]。研究发现冬虫夏草可通过降低链脲佐菌素所致糖尿病动物模型血肌酐、血胆固醇、血Ⅳ型胶原水平抑制肾组织纤维化，减轻肾脏病理变化对早期糖尿病肾病大鼠肾损伤，起一定保护作用[2-4]。此外，冬虫夏草对高糖环境下肾小球系膜细胞(GMC)分泌的CoI、CoIIV、纤维连接蛋白、透明质酸及层粘连蛋白有明显抑制作用，抑制GMC肥大和细胞外基质(ECM)合成增加，有望用于糖尿病肾病防治[5]。
TGF-β1是一种与DN发病密切相关的生长因子，可促进ECM合成，抑制基质降解，参与了肾间质纤维化的各个环节，在DN肾小球硬化和系膜基质堆积中起着关键作用。高血糖刺激ECM的形成主要是通过TGF-β途径，Oh等[6]研究显示，高糖与大鼠肾小球系膜细胞培养6h即可显著增加TGF-βmRNA表达并继续增加至48h，TGF-βmRNA在6h时为对照的1.5倍，高糖不仅刺激TGF-β的产生，亦可上调TGF-β受体。
本研究结果显示，冬虫夏草及福辛普利药物血清干预后24h和48h后，对高糖培养细胞增殖具有不同程度抑制，在相同作用时间下冬虫夏草各剂量组与正常对照组比较具有统计学意义(P<0.05或P<0.01 )；与高糖组比较具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，通过RT-PCR方法检测mRNA的表达，说明正常人肾小球系膜细胞存在TGF-β1mRNA表达，说明TGF-β1参与是细胞生理活动；通过高糖培养mRNA的表达增加，明显高于正常对照组。说明高糖状态刺激肾小球系膜TGF-β1的表达。而冬虫夏草及福辛普利药物血清干预后，可以显著抑制TGF-β1mRNA的基因表达，通过本实验结果推测冬虫夏草发酵菌粉可能是通过抑制高糖下HMC的增殖、下调TGF-β1基因表达延缓肾小球硬化[7]。但本研究仅通过对传统中药冬虫夏草延缓糖尿病肾病肾小球系膜细胞增殖进行初步探讨，其对DN的肾脏保护作用机制远未明确，尚有待更为全面、系统、深入的研究。
[参考文献]
[1] 白秀文.冬虫夏草的药用价值及临床应用[J].中国医药导报，2006，3(30)：80.
[2] 崔海月.冬虫夏草对糖尿病肾病大鼠肾损伤的保护作用研究[J].延边大学医学学报，2006，29(4)：252-255.
[3] 龚伟，黎磊石，陈丹，等.百令(冬虫夏草)对糖尿病大鼠转化生长因子β及其受体表达的影响[J].肾脏病与透析肾移植杂志，2006，15(4)：329-339.
[4] 胡杨青 ......
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