丹参酚酸B后处理脱细胞猪心脏瓣膜的形态学及生物力学研究(2)
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参见附件(2726KB，3页)。
1.4.2 组织厚度 每组各取10片瓣叶，分别应用 HD-10型厚度仪测量瓣膜组织厚度。
1.4.3 生物力学特性 用拉力试验机(Instron Company，SE08-292，USA)将瓣叶沿瓣膜长轴进行拉伸实验，标距为20mm，以10 mm/ min速度牵拉瓣叶至断裂，计算拉伸强度、最大变形量、断裂伸长比。
1.5 统计学处理
所有数据以均数±标准差(χ±s)表示，应用SPSS16.0统计软件。组间差异性判断应用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P < 0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 标本观察结果
新鲜组瓣叶呈淡红色，基本保持正常形态结构。经曲拉通脱细胞处理后瓣叶呈白色半透明，实验组经丹参酚酸B处理后瓣叶为乳白色。三组瓣叶均柔软，富有弹性。
2.2 光镜观察结果
HE染色显示，正常组可见大量间质细胞和蓝染的内皮细胞核，瓣膜结构紧密，Tx组和Tx-sal组脱细胞较完全，内皮细胞无残留，见封三图1、2、3。Masson染色显示，正常组胶原纤维排列整齐、无断裂现象。Tx组胶原纤维结构改变明显，纤维走向模糊，排列松散，波浪状结构消失；Tx-sal组胶原纤维三维网状结构完整存在，波浪状规则排列，纤维走向自然清晰，见封三图4、5、6。
2.3 电镜观察结果
扫描电镜显示两组去细胞瓣膜内皮细胞、间质细胞清除彻底，无残留。Tx组可见瓣膜支架结构明显改变，胶原纤维轻度断裂，形成深浅不一的沟。相比之下，Tx-sal组瓣膜三维网状结构规则、清晰，超微结构改变不明显。
2.4 组织厚度
组织厚度Tx组与加Tx-sal组分别为(0.73±0.03)mm和(0.75±0.05)mm，差异无统计学意义(P>0.05 )。
2.5 生物力学性能测定
Tx-sal组心脏瓣膜的抗拉强度、最大变形量、断裂伸长比明显高于Tx组(P<0.05)。见表1。
表1 各组生物力学性能测定结果(χ±s， n=10)
组别 抗拉强度(MPa)最大变形量(mm) 断裂伸长比(λ)
正常组 2.32±0.34 7.89±0.24 1.66±0.33
Tx组 2.21±0.37 8.15±0.77 1.25±0.18
3 讨论
近年来，随着组织工程学科的发展，组织工程心脏瓣膜(TEHV)能更好地解决人工瓣膜置换术后诸多的并发症，已成为目前瓣膜领域研究的热点[4，5]。理想的去细胞方法要求完全去除瓣膜细胞，降低免疫原性，又能保留天然瓣膜的胶原纤维、弹力纤维等细胞外基质成分，保持足够的机械强度以满足心脏瓣膜的功能需求[6，7]。Bodnar[8]用Triton-x100和脱氧胆酸钠去细胞法处理瓣膜较为理想，细胞去除彻底，血液相容性好，是两种良好的组织工程瓣膜支架的制作方法。但是两者都存在钙化和衰败以及黏附较为困难的问题。有研究表明[9]，机械应力变化是直接引起异种生物瓣膜腐败的重要因素之一，且承受应力大的部位也最容易发生钙化，长期的机械应力不仅导致瓣膜胶原纤维机械性损毁，还可使瓣膜变形产生间隙，大量的离子和血浆进入组织间隙聚集引起血栓发生，导致瓣膜衰败。因此，研究如何提高支架机械性能、减低移植物免疫原性、减少瓣叶钙化，具有重要临床意义。
丹参酚酸B(Salviaolic acid B)是丹参提取物的重要组成成分，为一种缩酚酸多羟基化合物，由一分子咖啡酸与三分子丹参素缩合而成，分子式C36H30O16。大量研究表明，salB能捕捉超氧阴离子；清除氧自由基；减低内皮细胞间黏附因子(ICAM-1)的表达，减少白细胞浸润；还可避免细胞内的钙超载，降低钙化[10]。本研究结果显示，经丹参酚酸B改性处理脱细胞猪心脏瓣膜的弹性纤维、胶原纤维等细胞外基质的三维网状结构明显优于传统的曲拉通法，此外，拉力力学检测结果表明，实验组脱细胞猪心脏瓣膜抗拉强度、最大变形量、断裂伸长比明显高于对照组，显示了优良机械性能，提高瓣膜抗疲劳性，有助于延长置换术后瓣膜的使用寿命。
综上所述，经丹参酚酸B后处理的心脏瓣膜内皮细胞去除彻底，胶原纤维保存完整，机械性能较为稳定，是制备组织工程心脏瓣膜支架的优良方法，并显示可观的临床应用前景。
[参考文献]
[1] Knight RL，Wilcox HE， Korossis SA. The use of acellular matrices for the tissue engineering of cardiac valves[J]. Proc Inst Mech Eng H，2008，222(1)：129-143 .
[2] Kim WG，Park JK，Lee WY. Tissue engineered heart valve leaflets： an effective method of obtaining acellularized valve xenografts[J]. Int J Artif Organs，2002，25 ：791 - 797.
[3] Iop L，Renier V，Naso F，et al. The influence of heart valve leaflet matrix characteristics on the interaction between human mesenchymal stem cells and decellularized scaffolds[J]. Biomaterials，2009，30(25)： 4104-4116.
[4] Filová E，Straka F，Mirejovsky T，et al. Tissue-engineered heart valves[J].Physiol，2009， 58 Suppl 2： S141-158 ......
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