MTT法对大肠癌的药敏实验及临床应用研究(2)
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参见附件(2758KB，3页)。
1.2.2 试剂 培养液RPMI-1640(美国Sigma公司)、10%十二烷基硫酸钠(SDS长沙科泰科研试剂有限公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)、四甲基氮唑蓝MTT(美国Sigma公司)、胶原酶(美国Sigma公司)、胰蛋白酶(美国Sigma公司)。
1.3 实验仪器
全自动酶标仪statFax2100(美国)。CO2培养箱(FORMA 3111美国)。
1.4 体外药敏试验
无菌取新鲜大肠癌手术标本，在含抗生素培养基中浸泡20min，剪成0.5～1.0mm3碎块，置50mL离心管中，加10mL含混合消化酶的培养基，37℃消化1h。200目筛网过滤，获单细胞悬液，用1640培养基洗2次。台盼蓝染色，计活肿瘤细胞数。大肠癌细胞培养于含20%胎牛血清的1640培养基中，以0.25%胰酶消化后制成1×105/mL细胞悬液，于2个96孔板中每孔接种200μL，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24h后，于96孔板中加入药物，测定细胞生长。96孔板分为空白组、对照组和药物实验组。药物实验组又分为：①单药组，伊立替康全量、奥沙利铂全量、氟脲嘧啶全量；②两药联合化疗组，伊立替康全量+奥沙利铂全量、伊立替康全量+氟脲嘧啶、奥沙利铂全量+氟脲嘧啶；③三药联合化疗组，伊立替康全量+奥沙利铂全量+氟脲嘧啶、伊立替康半量+奥沙利铂半量+氟脲嘧啶、伊立替康全量+奥沙利铂半量+氟脲嘧啶、伊立替康半量+奥沙利铂全量+氟脲嘧啶。每组设4个复孔。单药组加入各自浓度药物100μL；2种药物联合用药时采用1︰1方案，使药物浓缩1倍后各加50μL，使每孔的药物浓度、体积和总量不变；3种药物联合应用时，采用1︰1︰1方案，使药物浓缩2倍后各加25μL，再补加25μL培养基以使药物浓度及总量不变。置于37℃、5%CO2培养箱48h后，每孔加入MTT 20μL，继续培养4h，弃培养液，每孔加DMSO 150μL，充分溶解10min。全自动酶标仪(测定波长490nm、参比波长630nm)测定各孔光密度值(OD值)，空白组OD<0.005、实验组OD>0.1为有效实验。
1.5 数据处理
计算平均抑制率(IR)，IR＝[1-(用药组平均OD值-空白组平均OD值)/(对照组平均OD值-空白组平均OD值)]×100%。IR标准采用1978年全国抗癌药物会议制定的《肿瘤药物通用指标》IR<30%为不敏感，归阴性；30%
1.6 统计学处理
用SPSS13.0统计软件处理，计数资料采用行乘列的卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
不同标本的药物敏感性存在明显差异，单药中最有效的药物依次为伊立替康、奥沙利铂和氟尿嘧啶，敏感率分别为35.0%、27.5%和20.0%；两药联合应用均优于各自单药的抑制效果(P<0.05)，伊立替康联合奥沙利铂弱于伊立替康或奥沙利铂与氟尿嘧啶联合的抑制效果(P<0.05)；三药联合应用的抑制效果显著优于两药联合(P<0.05)，三药全量及半量联合应用效果差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
3 讨论
MTT法是一种近年来研究较广泛的方法，该方法由Mosman于1983年首创。国内外学者采用MTT法在肿瘤体外药敏试验方面积累了一定的临床和实验资料，认为该法是简便、快捷、经济的药敏方法，临床相关性较高[3-5]。不仅对临床个体化疗有重要指导意义，而且在研究抗癌药物相互作用、耐药修饰剂对细胞毒性的影响、体外新药的筛选以及最终实现个体化疗方面都有深入研究价值。Tomita K等研究表明，体外药敏试验与体内临床用药不敏感(阴性结果)相符合率均为90%。由此表明，不论是真阳性及真阴性符合率，应用具有简便、快速、敏感、结果可靠等优点的MTT法试验，对于制定临床肿瘤合理化疗策略具有指导意义。
本检测结果显示，不同患者大肠癌标本对化疗药物的敏感程度有明显的异质性。3份未检测到敏感药物及药物组合，4份检测到对所有药物及药物组合均敏感。提示化疗前进行体外药敏检测，可筛选出患者相对敏感的药物，以避免盲目用药的损害。此外，试验显示，大肠癌对单药的敏感性普遍较差，对CPT、L-OHP和5-FU的中度敏感率分别为10.0%、7.5%和2.5%。此结果与大肠癌属化疗低度敏感的临床观察相符合。现在，临床上多用2种或2种以上的药物进行联合化疗，但发表的体外药敏试验结果多是单药试验结果，这与临床实际应用有较大距离。因此，我们尝试体外检测临床常用的三种药物氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康单药应用、两药及三药(全量或半量)联合应用的敏感性。结果显示，不同标本的药物敏感性存在着明显差异，单药中有效的药物依次为伊立替康、奥沙利铂和氟尿嘧啶，敏感率分别为35.0%、27.5%和20.0%；两药联合应用均优于各自单药的抑制效果(P<0.05)，伊立替康联合奥沙利铂弱于伊立替康或奥沙利铂与氟尿嘧啶联合的抑制效果(P<0.05)；三药联合应用的抑制效果显著优于两药联合(P<0.05)，三药全量及半量联合应用效果差异无统计学意义(P>0.05)。
在本实验中，伊立替康、奥沙利铂及氟脲嘧啶三药联合显示了强大的抗肿瘤活性，明显优于伊立替康或奥沙利铂与氟脲嘧啶的两药联合的效果。Falcone等[5]进行的一项Ⅲ期临床研究表明，应用伊立替康、奥沙利铂及氟脲嘧啶三药联合的FOLFOXIRI方案治疗晚期转移性大肠癌显示出较好的抗肿瘤活性，与伊立替康、氟脲嘧啶二药联合FOLFIRI方案相比在RR、PFS和OS均取得明显的改善。
国外也有研究表明，三者联合应用可能通过协同作用而增强抗肿瘤效果。本实验显示，半量与全量的三药联合组内差异不显著，既半量联合可取得全量联合应用相同的效果。这种半量的化疗方案可以在保证疗效的前提下减少毒副作用，为临床应用三药小剂量化疗提供了实验依据。但我们检测药敏的病例数较少，尚需更多的数据和进一步研究，才能为临床应用提供更有价值的试验依据。
[参考文献]
[1] Letwin R.Chemosensitivity testing[J].Clin J Oncol Nurs，2001，5(5)：195-200.
[2] Untch M，Ditsch N，Langer E，et al.Chemosensitivity testing in gynecologic oncology—dream or reality?[J].Recent Resuits Cancer Res，2003，161：146-158.
[3] Cao W，Yang W，Lou G ......
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