斑马鱼髓过氧化物酶基因的cDNA克隆及结构与功能分析(1)
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[摘要] 目的 髓过氧化物酶(MPO)是动物中性粒细胞中的一种血红素蛋白，有多种生物活性。本研究拟通过分析原始脊椎动物斑马鱼MPO基因的序列和结构，为研究动物MPO演化提供证据。方法 利用RACE技术和生物信息学技术从斑马鱼cDNA中鉴定了一个MPO基因并对其序列和结构进行分析。结果 通过序列比对和结构分析发现，斑马鱼MPO与哺乳动物、鸟类和其他鱼类的髓过氧化物酶基因具有高度序列和结构的相似性。结论 斑马鱼的MPO在动物MPO演化过程中处于过渡地位。
[关键词] 髓过氧化物酶；RACE；斑马鱼
[中图分类号] Q78 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2011)24-08-03
Cloning and Characterization of Myeloperoxidase Gene from Zebrafish (Danio rerio)
DONG Chaohua
College of Life Sciences， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China
[Abstract] Objective Myeloperoxidase (MPO) is a hemoprotein present in the animal neutrophils and it has a variety of biological activities. The objective of the present study is to provide evidences for investigating the evolution of MPO. Methods A new MPO gene was cloned and characterized using RACE technology from zebrafish. Sequence and structural analysis was performed using bioinformatics technology. Results Sequence alignment and structural analysis showed that zebrafish MPO had high sequence and structural similarities with other myeloperoxidase from mammals， birds and other fishes. Conclusion MPO identified from zebrafish is in a transitional position.
[Key words] Myeloperoxidase； RACE； Zebrafish
髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)是动物中性粒细胞中的一种血红素蛋白，有多种生物活性，与许多疾病的发生与发展密切相关[1-4]。MPO不仅在高等哺乳动物中存在，在低等无脊椎动物如虾、蟹、果蝇中都发现了MPO的同系物。从无脊椎动物到脊椎动物，MPO功能发生了很大的变化[1-6]，MPO功能演化是一个有趣的课题。斑马鱼作为一种典型的模式生物研究分子演化具有突出的优势。本研究以斑马鱼为材料鉴定其MPO基因，并对其结构与功能进行分析，以期为MPO功能的演化提供证据。
1 资料与方法
1.1 实验动物
实验用斑马鱼从本地观赏鱼商店购买。
1.2 RNA提取及cDNA第一链合成
总RNA提取和cDNA第一链合成利用TaKaRa公司的RNA isolation及反转录试剂盒，根据试剂制造商提供的说明进行。基因末端的克隆用Clonetech公司的SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit进行。
1.3 生物信息学分析
基因序列和蛋白质序列相似性分析用BLAST软件进行，多重序列比对用Clustal W程序和多重序列显示程序。信号肽预测用SignalP 3.0程序，进化树构建用MEGA 4.0程序和邻位相连法(neighbor-joining)。蛋白质结构特征分析用蛋白质分析专家系统和运用简单模块构架搜索工具进行。
2 结果
2.1 基因克隆和序列分析
用tBLAST程序搜索斑马鱼WSG库，获得目标基因的候选序列并以此序列为基础，通过RACE技术获得基因全长，命名为DrMPO(图1)。
DrMPO全长3329bp，包括415bp的3’末端非编码序列和404bp的5’端非编码区。编码区序列为2511bp，编码836个氨基酸。利用ExPASy系统推定DrMPO蛋白质分子量为92.7kDa，理论等电点为8.40。用SMART程序对推定的氨基酸序列进行结构预测和位点扫描。DrMPO在N末端有一个19个氨基酸的信号肽，同时还包含有两个过氧化物酶结构域和一个C1q结构域。
2.2 序列比对
通过BLAST程序搜索蛋白数据对DrMPO进行同源性分析。DrMPO与鳜鱼Siniperca chuatsi、原鸡Gallus gallus、鲶鱼Ictalurus punctatus、非洲爪蟾Xenopus laevis、大西洋鲑Salmo salar、人Homo sapiens和小鼠Mus musculus的MPO分别有69%、57%、82%、58%、80%、64%和57%的相似性。
通过将DrMPO与其他物种的MPO进行多重比对，发现DrMPO与其他动物MPO在过氧化物酶结构域高度保守(图2)，其他动物大都没有C1q结构域。
2.3 多聚系统树的构建
将不同物种MPO按邻接法构建系统树。系统树显示，DrMPO与鲶鱼的MPO组成一个群体而鳜鱼和大西洋鲑鱼则组成另外一个小群，这两个小群组成一个大群，区别于小鼠和人组成的哺乳动物群以及原鸡和非洲爪蟾组成的群。聚类结果显示，DrMPO与鲶鱼的MPO亲缘关系最近，而原鸡与两栖类的非洲爪蟾的MPO亲缘关系最近。聚类结果显示了MPO的歧化趋势与动物的演化地位相一致，处于演化的过渡地位(图3)。
2.4 空间结构模型的建立
利用SWISS-MODEL软件对DrMPO的空间结构进行预测，并与经典的人MPO空间模型进行比较。DrMPO与经典的MPO具有相似的空间结构(图4) ......
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