标本处理方法对尿液蛋白电泳的影响(2)
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1.4.3 图象分析 图像分析采用Quantity one蛋白分析软件，分析过程包括通过自动检测和手工标记进行蛋白质斑点检测。
1.5 统计学处理
数据处理采用SPSS11.5统计软件进行，检测蛋白图谱质量分析采用描述法，点数比较组间相关性采用方差分析，组间比较采用t检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 电泳条带蛋白电泳图谱质量分析
三种蛋白沉淀方法处理的尿液标本蛋白电泳图谱比较发现，TCA/丙酮沉淀法提取尿液蛋白质样品的蛋白及背景清晰，丙酮沉淀法和ACN/0.1%TFA沉淀法处理的尿液标本电泳图谱蛋白及背景清晰度较差，有较多干扰条纹。见图1。
图1 丙酮沉淀法(a)和ACN/0.1%TFA沉淀法(b)所得到的尿液2-DE胶，(c)尿液在20%TCA中-20℃沉淀2h，经丙酮沉淀，离心干燥后所得到的液体置于-20℃24h后进行2-DE
2.2 三种蛋白沉淀方法电泳图谱点数分析
丙酮沉淀法蛋白电泳图谱蛋白点数是(24.0±7.2)，ACN/TFA沉淀法蛋白电泳图谱蛋白点数是(36.0±11.4)，TCA/丙酮沉淀法蛋白电泳图谱蛋白点数是(79.0±15.9)，ACN/TFA沉淀法及TCA/丙酮沉淀法蛋白电泳图谱蛋白点数高于丙酮沉淀法，TCA/丙酮沉淀法蛋白电泳图谱蛋白点数高于ACN/TFA沉淀法。见表1。
3 讨论
尿液是临床常用的检测标本，其中尿蛋白的检测是主要的检测项目之一，尿液中微量蛋白的定性及定量检测能够为肾小球的滤过功能评价及为某些疾病异常蛋白质的排泄提供参考依据[1]，尿液标本中蛋白含量较少，一般每天经泌尿系排泄的蛋白总量低于150mg，常规的检测方法很难取得较为精确的检测效果，泌尿系是体内物质排泄的主要途径之一，因此尿液的成分变化较大，在不同时间及不同个体的尿液标本中物质含量也存在较为明显的差异[2]。
肾脏是无机盐的主要排泄途径，因此尿液中无机盐的含量较为丰富，而且与个体的饮食及健康状况等密切相关，个体差异较为明显，因此为了减少无机盐等杂质的干扰，提高尿蛋白的检测效果，在临床检测过程中常需对尿液标本进行预处理[3]，进行蛋白浓缩、脱盐等处理，增加样品中的蛋白浓度，提高检测的效果。尿液蛋白的预处理方法较多[4]，如沉淀、固态提纯法、离心过滤、超速离心等方法，但是标本处理的过程可能伴随蛋白质的丢失，而且采用离心、固态提纯等方法对于管型杂质等去除能力较差，丙酮、ACN均为标本蛋白沉淀的常用试剂[5]，能够沉淀标本中的蛋白，但是也存在着在沉淀过程中蛋白丢失回收率较低，不能避免无机盐干扰等问题，因此采用试剂对尿液标本进行脱盐能够提高蛋白的检测效果，减少无机盐的干扰及无机盐电荷引起的蛋白异常聚集等[6]。
我们采用TCA对丙酮沉淀后尿液标本进行脱盐处理，TCA能消除干扰等电聚焦的盐和其他一些分子，降低导电能力。结果发现，丙酮沉淀后采用TCA处理的尿液标本蛋白电泳后的图谱更为清晰，蛋白点数明显提高，蛋白及无机盐杂质引起的横纹条带干扰减少，其蛋白点数高于单独应用丙酮沉淀及CAN/TFA连续沉淀。研究结果说明采用丙酮沉淀蛋白、TCA除盐的尿液标本预处理放大，能够提高尿液标本中蛋白的检测效果。
[参考文献]
[1]谢健敏，张成禄，于新发，等. 尿微量白蛋白及尿蛋白定量测定在慢性肾脏病患者肾功能评估中的价值[J]. 实验与检验医学，2011，29(1)：41-42.
[2] Zhou H，Yuen PS，Pisitkun T，et al. Collection，storage，preservation，and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery[J]. Kidney Int ......
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