浙江省萧山区轮状病毒A组G型和P型基因同源性比较与进化分析(2)
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表1A组轮状病毒G分型引物序列
引物G分型 位置 序列(5’---3’) 产物(bp)
Beg9 G(+) 1-28GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG
End9G(-) 1062-1036GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG1062
aAT8G8(+)178-198GTCACACCATTTGTAAATTCG 885
aBT1G1(+)314-335CAAGTACTCAAATCAATGATGG 749
aCT2G2(+)411-435CAATGATATTAACACCTTTTCTGTG652
aDT4G4(+)480-498CGTTTCTGGTGAGGAGTTG583
aET3G3(+)689-709CGTTTGAAGAAGTTGCAACAG374
aFT9G9(+)757-776CTAGATGTAACTACAACTAC306
表2A组轮状病毒P分型引物序列
引物G分型位置 序列(5’---3’) 产物(bp)
4Con3 P(+)11-32 TGGCTTCGCCATTTTATAGACA
4Con2 P(-) 868-887ATTTCGGACCATTTATAACC876
1T1 P[8](-) 339-356 TCTACTTGGATAACGTGC345
2T1 P[4](-) 474-494 CTATTGTTAGAGGTTAGAGTC 483
3T1 P[6](-) 259-278 TGTTGATTAGTTGGATTCAA267
4T1 P[9](-) 385-402 TGAGACATGCAATTGGAC391
5T1 P[10](-) 575-594 ATCATAGTTAGTAGTCGG594
1.4ELISA检测轮状病毒
严格按照人A组轮状病毒ELISA检测试剂盒说明书进行操作，检测粪便中的A组轮状病毒。
1.5核酸的提取和PCR扩增基因
1.5.1核酸的提取 采用PBS溶液将粪便标本制备成10%的粪便悬液，离心后取200μL上清，根据Viral Nucleic Acid Extraction Kit Ⅱ(Geneaid)的操作说明书提取轮状病毒的核酸RNA，核酸样品的最终洗脱体积为50μL，分装并保存于-70°C备用。
1.5.2G型PCR分型 一次扩增反应体系：Beg9(20μmol/L) 1μL，End9(20μmol/L) 1μL，病毒RNA 5μL，DEPC处理H2O 3μL，98℃变性5min，迅速置于冰内冷却。在上述溶液中加入以下反应液：10×ExTaq Buffer5μL，dNTP(各10mmol/L) 1.6μL，ExTaq酶 0.25μL，AMV反转录酶(10U/μL) 0.2μL，DEPC处理H2O 32.95μL。
反应条件：42℃ 30min；94℃ 5min；30个循环(94℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 1min)；72℃终延伸7min。
二次扩增反应体系：总反应体积25μL ，10× ExTaq Buffer 2.5μL，dNTP(各10mol/L) 0.8μL，ExTaq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.125μL，AT8(20μmol/L) 0.5μL，aBT1(20μmol/L)0.5μL，aCT2(20μmol/L) 0.5μL，aDT4(20μmol/L) 0.5μL，aET3(20μmol/L) 0.5μL，aFT9(20μmol/L) 0.5μL，End9(20μmol/L) 0.5μL，一次产物1μL，加H2O至25μL。
反应条件：94℃ 1min；30个循环(94℃ 30s，42℃ 30s，72℃ 1min)；72℃ 7min。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,根据DNA分子量标准判断扩增条带大小。
1.5.3 P型PCR分型 一次扩增反应体系：4Con2(20μmol/L)1μL，4Con3(20μmol/L) 1μL，病毒RNA 5μL，DEPC处理H2O 3μL，98℃变性5min ......
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