表皮干细胞分化结膜上皮细胞基因检测的实验研究(2)
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1.2.3表皮干细胞与结膜上皮细胞共培养的诱导分化取1～2代表皮干细胞作为实验细胞，以5×106个/mL接种于6孔Transwell培养板中，实验组insert池中加入1mL结膜上皮细胞(细胞浓度为1×104个/mL)作为饲养细胞；对照组insert池中仅为相同体积的上皮细胞培养液，5% CO2、37℃细胞培养箱培养1、3、5、7d后，弃细胞培养液，分别取对照组和实验组细胞提取RNA，进行实时定量RT-PCR检测目的基因β2-微球蛋白、角蛋白K13的表达情况。
1.2.4细胞总RNA的提取吸出6孔Transwell培养板中的培养液，每孔加入1mL TRIZOL® Reagent，振荡混匀，15～30℃温育5min，每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，振荡15s，然后于15～30℃放置2～3min，于2～8℃离心样品15min(<12 000g)，将上层水相移至新管中，每1mL原始Trizol用量加入0.5mL异丙醇，室温放置10min，4℃离心(<12 000g)，弃上清，每1mL Trizol用量用1mL 75%乙醇洗涤，振荡样品，然后7 500g离心样品5min(如果用来富集小分子RNA，则不用75%乙醇洗涤，直接进入下一步)，空气干燥RNA 10min，用适量RNase free水溶解，于60℃温育10min，置于-80℃备用。
1.2.5引物的构建按照参考文献[4]构建设计：β-actin正向引物：5’-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3’，β-actin反向引物：5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3’；β2M正向引物：5’-GAATTGCTATGTGTCTGGGT-3’，β2M反向引物：5’-CATCTTCAAACCTCCATGATG-3’；CK13正向引物：5’-GAGGAATGGTTCCACGCCAAG-3’，CK13反向引物：5’-GCGACCAGAGGCATTAGAGGT-3’。
1.2.6PCR扩增取3μL逆转录反应产物做模板，根据试验目的加入相应的正向引物和反向引物。PCR反应总体系为20μL。条件为95℃ 5min，1个循环；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，共30个循环；72℃ 10min，1个循环。
1.2.7荧光定量PCR按照SYBR(R)Premix Ex TaqTM试剂盒的说明书进行。取1μL逆转录反应产物做模板，20μL反应体系，引物浓度为10nM/μL，各加入0.5μL。SYBR(R)Premix Ex TaqTM 10μL，用双蒸水补平至20μL。反应程序为94℃ 10s，1个循环；94℃ 5s，58℃ 31s，读板，40个循环。数据分析采用2-△△CT方法。
2结果
Realtime RT-PCR的结果见图1、图2。结果可见实验组表皮干细胞5d及7d后β2-微球蛋白mRNA的表达明显上调，分别为(300±26)%(P<0.01)、(300±13)%(P<0.01)；CK13 mRNA表达上调(480±110)%(P<0.01)、(760±53)%(P<0.01)。与对照组相比，β2-微球蛋白mRNA及CK13 mRNA表达都有显著性上调。
图1表皮干细胞中β2-微球蛋白mRNA的表达水平5d实验组细胞中β2-微球蛋白mRNA表达上调(300±26)%(P<0.01)；7d实验组细胞中β2-微球蛋白mRNA表达上调(300±13)%(P<0.01)，其中n=5，6
图2表皮干细胞中CK13 mRNA的表达水平5d实验组细胞中CK13 mRNA表达上调(480±110)%(P<0.01)；7d实验组细胞中CK13 mRNA表达上调(760±53)%(P<0.01)，其中n=5，6
3讨论
角蛋白(keratin)是上皮细胞中特异性的中间丝成分。已知的细胞中表达的各种角蛋白家族亚单位成员具有组织特异性，并且和细胞的分化相关[5]。例如：Krenzer等[6]报道：在正常结膜上皮细胞中表达角蛋白K13/K4/K8/K19/K7。Dota等[7]研究报道：通过对38例正常结膜组织的上皮细胞建立的cDNA文库，检测出角蛋白K13是结膜细胞转录中表达最丰富的基因，且该基因与细胞骨架的合成有关，并认为K13有可能是有关眼表结膜细胞分化最敏感的基因。而且早期的研究中也证明：在结膜上皮细胞的免疫组化鉴定中结膜上皮细胞可被特异性角蛋白K13抗体标记，而在皮肤干细胞中并无相应抗体的表达[8]。
β2-微球蛋白(beta-2-microglobulin)是HLA抗原的成分之一。虽然有关该种蛋白的功能尚未明确，但是该蛋白存在于泪液中并可能来源于结膜上皮细胞中。并且在正常状态下泪液中的β2-微球蛋白浓度明显高于炎症时泪液中浓度。Dota等[7]研究中也同时检测到β2-微球蛋白也是结膜上皮细胞转录较高的基因，因此本研究将CK13和β2-微球蛋白作为结膜上皮细胞标记性(特异性)的高效表达基因。
近年来，相关文献[9-11]报告了通过组织工程技术将成体干细胞体外合成生物替代品，并对其组织功能改良用于眼表重建的临床治疗新技术。然而，成功的眼表重建依赖于两个重要因素。其一，具有高分化、高增殖能力的干细胞；其二，干细胞的载体组织。本研究中应用具有高分化、高增殖能力的表皮干细胞为种子细胞，从而保证眼表重建治疗中能获得可靠的细胞源。我们早期的相关研究中[4]报告应用同源异体的结膜去细胞基质膜为干细胞载体膜，不仅可保证具有良好的组织相容性，而且也确保在体外模拟形成结膜上皮细胞增殖的组织微环境。从而诱导表皮干细胞定向分化、增殖 ......
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