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编号:12144138
中华大蟾蜍抗菌肽对癌细胞的生长抑制作用(2)
http://www.100md.com 2011年12月25日 陈丽萍 何丽莉 巴云飞
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    参见附件(2871KB,3页)。

     1.2.2 凝胶过滤层析半纯化抗菌肽 将SephadexG25柱装好后,用超纯水以1.0mL/min的流速冲洗2~3倍柱体积。再用流动相(Na2HPO4-NaH2PO4,pH6.0)以3.0mL/min的流速平衡2~3倍柱体积。在215nm、280nm波长下监测,上样及洗脱在SephalexG25色谱柱平衡后,加样品溶液1~2mL,用流动相溶液以3.0mL/min的流速进行洗脱,将每个峰分别收集,以S.aureusATCC25923作为实验样品检测的指示菌,药敏片法检测各收集峰的抑菌效果。

    1.2.3 制备型反相高效液相色谱纯化抗菌肽 样品经凝聚过滤层析后,收集具有抗菌活性的物质并将其真空冷冻干燥,然后溶于含0.1%三氟乙酸水溶液中,然后用10000转离心5min,吸取上清液弃沉淀,接着把上清液过0.22μm的滤膜。A液为含0.1%三氟乙酸的超纯水,B液为含0.1%三氟乙酸的乙腈。流速设置为2mL/min,每次上样2mL,根据色谱曲线中的色谱峰,分步收集各峰的样品,并记录时间,以S.aureus ATCC25923作为实验样品检测指示菌,检测各峰的抑菌活性,将具有抗菌活性物质即中国大蟾蜍抗菌肽真空冷冻浓缩。

    1.2.4 癌细胞杀伤作用 将大肠癌细胞SW480用DMEM培养基加上10%胎牛血清培养在96孔板中,浓度为5×105cell/孔,终体积为100μL,过夜培养12h。我们将抗菌肽样品经过0.45μm滤器过滤,并将其浓度稀释为0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL,作用于SW480细胞(抗菌肽组),24h显微镜观察结果,与空白对照组对比癌细胞变化情况。

    1.2.5 对SW480细胞的生长抑制作用 多肽对肿瘤细胞增殖的抑制作用是用MTT-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium romide测定的[7-10]。我们将大肠癌细胞SW480用DMEM培养基加上10%胎牛血清培养在96孔板中,浓度为5×103cell/孔,终体积为100μL,贴壁培养24h,培养条件温度37℃,5%的CO2,湿度95%。把中华大蟾蜍抗菌肽用PBS充分溶解,不同浓度的多肽与肿瘤细胞共培养24h(多肽在96孔板中最终浓度为0μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL,60μg/mL,80μg/mL,100μg/mL,200μg/mL,400μg/mL),并且每个浓度要有三个平行孔。吸掉培养液,然后加入100μL的DMEM培养基和20μL的MTT(浓度为5mg/mL)继续培养4h。然后吸掉上层培养液后加入150μL的DMSO后,震荡10min后,用酶标仪在570nm下测量其吸光度值。

    2 结果

    2.1 分离纯化结果

    皮肤分泌物的粗提物经过凝胶过滤层析纯化后,以280nm为监测波长,收集各峰,并以S.aureusATCC25923作为实验样品的指示菌,药敏片法检测抑菌活性峰,确定其中4号峰为活性峰。利用制备型反向高效液相色谱,C18反相色谱柱继续对凝胶过滤层析活性峰作进一步的分离,以215nm作为监测波长,收集各峰,同样以S.aureusATCC25923作为实验样品的指示菌测定各收集峰的抑菌活性,最终获得中华大蟾蜍抗菌肽。图1为粗提物凝胶过滤层析及高效液相色谱分离图;图2为凝胶过滤层析(左)、高效液相色谱(右)活性峰的抑菌结果。

    2.2 对SW480杀伤作用

    将中华大蟾蜍抗菌肽作用于大肠癌细胞SW480,倒置显微镜下观察,对照组的细胞结构完整,而在抗菌肽组中,当抗菌肽浓度达到0.1mg/mL时细胞结构发生明显的变化,细胞变小、变圆,折光率变大,细胞整体明显皱缩,边缘不光滑,细胞间隙明显增大,漂浮的死细胞增多,且伴有细胞碎片的悬浮。当抗菌肽浓度达到0.3mg/mL、0.5mg/mL时,看不到细胞存在(图3)。

    2.3 MTT实验结果

    不同浓度抗菌肽组作用于大肠癌细胞48小时后,其抑制率曲线如图4所示。中华大蟾蜍抗菌肽对大肠癌细胞SW480细胞有生长抑制作用呈现量-效关系。当中国大蟾蜍抗菌肽的浓度达到60μg/mL大肠癌细胞SW480细胞开始有抑制作用,当浓度达到200μg/mL时抑制率幅度增长缓慢,在浓度(10~40)μg/mL时并没有变现出抑制作用。

    3 讨论

    两栖动物抗菌肽的抗癌作用机理比较复杂[11],目前主要以细胞骨架损伤学说为主,认为抗菌肽对正常的哺乳动物细胞和肿瘤细胞均具有损伤作用,但由于哺乳动物细胞骨架完整,且修复快,故抗菌肽对其不造成最终损伤,而肿瘤细胞骨架不完整,当被抗菌肽作用以后,得不到及时有效的修复而导致最终损伤。还有研究者认为抗菌肽可以从细胞膜、线粒体、核膜、细胞核染色体DNA、溶酶体等几个方面影响癌细胞的生存[12],且能调动机体免疫系统,抵抗癌瘤的侵袭,这主要是从体液方面来实现。Jaynes等报道以CecropinB为蓝本,合成一种新型的抗菌肽,不仅对细菌、真菌和原虫有较强的穿透作用,而且对肿瘤细胞有明显的杀伤作用;Chen JY等[13]还证实抗菌肽Epinecidin-1抑制人白血病细胞的增殖,诱导细胞凋亡;赵瑞君等[14]报道家蝇成虫抗菌肽对肿瘤细胞109、K562、Daudi及T24的有效杀伤力都在85%以上,本实验通过对中华大蟾蜍乙醚刺激获得皮肤分泌物,利用分离凝胶过滤层析和反向高校液相色谱层析两种分离纯化方法,获得中华大蟾蜍抗菌肽。实验结果显示,中华大抗菌肽除了具有抗菌效果,而且对大肠癌细胞SW480同样具有很好的抑制作用。我们利用细胞形态学的方法,在倒置显微镜观察到细胞的一些变化,当抗菌肽浓度达到0.1mg/mL时细胞结构发生明显的变化,细胞贴壁性下降 ......

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