外周血HBVcccDNA检测的临床应用(2)
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参见附件。
2.2 单个核细胞cccDNA的检测
单个核细胞cccDNA的检测只有急性乙型肝炎组有7例阳性，且浓度明显低于外周血的含量。
2.3 血浆cccDNA与HBV-DNA、ALT、AST、TBIL秩相关
血浆cccDNA与HBV-DNA、ALT、AST、TBIL秩相关系数分别为0.817、0.402、0.450、0.221；乙型肝炎患者血浆中cccDNA水平与HBV-DNA的秩相关系数 Rs=0.817, P<0.01，可以认为乙型肝炎患者血浆中cccDNA与HBV-DNA水平存在正相关。乙型肝炎患者血浆中cccDNA水平与AST的秩相关系数Rs=0.450, P<0.01，可以认为乙型肝炎患者血浆中cccDNA水平与AST存在正相关。乙型肝炎患者血浆中cccDNA水平与ALT的秩相关系数Rs=0.402, P<0.01,可以认为乙型肝炎患者血浆中cccDNA水平与ALT存在正相关。乙型肝炎患者血浆中cccDNA水平与TBIL的秩相关系数Rs=0.221, Rs<0.4，根据相关系数重测信度评价，R应达到0.4以上，可认为cccDNA水平与TBIL相关性无意义。
3 讨论
乙型肝炎病毒的复制是一种保守的机制，在转录后模板仍然完整。乙肝DNA的复制，cccDNA是前基因组mRNA合成的模板，转录前基因组RNA，逆转录产生负链DNA，再合成双链DNA，继而成熟为cccDNA，是一个连续的过程[7]。cccDNA的产生过程相当复杂，目前尚未对cccDNA的形成有明确的结论，但cccDNA作为乙肝DNA的复制模板是感染病程的关键因素，所以乙型肝炎治疗的关键因素是清除和抑制cccDNA。cccDNA的检测特别是外周血cccDNA在临床上具有重要作用，但相关资料不多。由于肝组织标本取材限制，直接cccDNA维持和清除机制进行研究受到严重阻碍，到目前为止体内cccDNA的浓度、运转和清除机制都还知之甚少。我们可以进行假设，转氨酶等酶类存在于肝细胞胞质和线粒体中，这些物质在肝细胞损伤时可以直接释放入血，同理细胞核内的ccDNA分子在肝细胞损伤时也应该可以释放到血液中，而且这种释放会随着肝损程度的增加而增加。对于同一个患者而言，在不同时间段内，其cccDNA水平应该也相应发生变化，对判断病情有意义。目前通过肝活检来监测乙肝患者肝组织中的cccDNA水平变化存在着一定困难，因而监测外周血中的cccDNA动态变化更具有现实意义。
本课题对86例乙型肝炎患者进行分组，使用实时荧光定量PCR法检测患者血浆中cccDNA。急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、HBsAg无症状携带者三组之间cccDNA分布位置有差异；86例患者血浆cccDNA水平与ALT、AST存在正相关，而这两个指标可以代表肝功能损害。但患者血浆中cccDNA与血浆中TBIL并无相关性，可能因为TBIL升高是反应重度肝损的指标，当有大量肝细胞损伤坏死时TBIL才会升高，当肝细胞炎症和轻度损伤时其升高并不明显。因此，血浆检测出的cccDNA可以作为肝脏损害的标志，可以反映乙肝患者病情进展及程度，同时也反映了实时荧光定量PCR法检测乙型肝炎患者血浆中HBV cccDNA灵敏度较高、特异性强，可以应用于临床来监测乙肝患者血浆中cccDNA的水平及动态变化。
PBMC是体内免疫活性细胞的集合体，这些细胞在机体免疫应答中发挥重要作用。有研究表明[8]，HBV肝外的一个重要靶细胞就是PBMC，PBMC在乙肝免疫功能及病毒持续改变发挥特定的作用，在患者PBMC中检测出cccDNA，说明HBV可以感染PBMC。本文研究发现在乙型肝炎患者PBMC中cccDNA有7例阳性，占8.3%,说明HBV不但可以感染PBMC，而且可以在其中复制。但本实验PBMC中cccDNA检出率较低，且浓度均较低，与郑守虎[9]等报道的60%的阳性比率相差很大，可能为我们实验分组方式稀释了阳性比率，且我们本次实验采用ATP酶降解标本中的松弛环状DNA(rcDNA),大大减少了HBV-DNA对cccDNA检测造成的影响。本实验验证了cccDNA复制的肝外储存池的存在，可以解释血浆cccDNA水平与ALT、AST相关系数较低的原因：肝细胞不是外周血cccDNA的唯一来源，PBMC也是外周血中cccDNA的另一来源。PBMC中cccDNA的检测可以在乙型肝炎患者抗病毒治疗的疗效判断中发挥重要作用，抗病毒药物能否杀灭PBMC中的cccDNA也是观察乙肝复发的重要指标。
本实验存在的问题是: 实验样本量较小； cccDNA敏感度低于HBV-DNA；乙型肝炎患者的ALT、AST易受降转氨酶药物治疗等原因的影响等。有待进一步增加样本数量及动态观察慢性乙型肝炎患者发病各期的cccDNA水平，以确定其水平与乙肝患者病情轻重、病情进展的关系。
[参考文献]
[1] 吴月平,凌勇武,王世蓬,等.HBV感染者外周血白细胞中HBVcccDNA检测的临床价值的研究[J]. 放射免疫学杂志，2008，21(1)：89-90.
[2] Xu WS,Zhao KK,Miao XH,Ni W,etal.Effect of oxymatrine on the replication cycle of hepatitis B virus in vitro. World journal of gastroenterology 2010，16(16):189-191.
[3] 王洁,汪茂荣 .乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究进展[J] ......
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