中介素1-53对急性肺损伤大鼠SP-A及IL-18的影响(2)
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参见附件。
1.2试剂
IMD1-53粉剂：美国phoenix公司；脂多糖：美国sigma公司；兔抗大鼠IL-18多克隆抗体：北京博奥森生物公司；SP-AELISA试剂盒：上海地泽生物公司。
1.3 检测指标和方法
1.3.1 PaO2测定 留取腹主动脉血通过全自动血气分析仪进行检测。
1.3.2 肺 W/ D比值测定 正常组、急性肺损伤组和IMD1-53干预组动物做肺组织 W/ D比值测定。动物麻醉放血处死后开胸，游离双肺，结扎并剪下右肺，称取右肺中下肺叶湿重，后置55℃烤箱干燥，48 h后取出，称取干重，计算肺 W/D比值。
1.3.3 BALF中SP-A浓度测定 动物麻醉放血处死后开胸，游离双肺及主支气管，在气管分叉处结扎右肺，用4℃生理盐水5 mL灌洗左肺，反复抽吸7～8次，后取灌洗液3 mL移至离心管中，4℃下经 3000 r/min离心 10 min，留取取上清液备用，采用 ELISA方法测定 BALF中SP-A浓度。
1.3.4 病理检查 取右肺上叶组织块，用10%甲醛同定，予以常规石蜡包埋、切片，苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肺组织病理学变化。
1.3.5 免疫组化方法测肺单核巨噬细胞中IL-18的表达 将上述组织蜡块连续切片采用体积分数为3%过氧化氢封闭，微波炉抗原热修复，滴加一抗(兔抗大鼠IL-18多克隆抗体)及相应二抗工作液，滴加辣根过氧化物酶工作液，DAB显色，脱水，透明，封片。阳性表达为细胞浆内棕黄色颗粒。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统处理，分别测每视野的阳性表达的吸光度。
1.4 数据处理
所有实验数据用均数±标准差表示，用SPSS 19.0软件进行多组资料方差分析，各时点组间多重比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PaO2变化
在脂多糖诱发ALI后(B组)2 h，4 h点PaO2显著低于正常对照组(P < 0.01)，予IMD1-53干预后各时相 PaO2均显著升高(P < 0.01)。见表1。
2.2 大鼠肺 W/D变化
B组各时间点肺 W/D比值显著高于A组(P < 0.01)。IMD1-53干预后则比值减小(P < 0.05或P < 0.01)，C组各时间点均值均较A组高，2 h点相比差异有统计学意义(P < 0.01)，而4 h点差异无统计学意义(P > 0.05)。见表1。
2.3 组织病理学变化
B组大体标本可见肺组织肿胀，散在出血点；光镜下观察见肺泡间隔明显增宽，肺泡壁完整性破坏，肺组织大量炎症细胞浸润，肺泡腔红细胞及单核巨噬细胞渗出，局部透明膜形成，伴局灶性肺不张和肺气肿。随病程的延长，病变程度逐步加重，C组各时相组病变程度均较B组各相应时相组减轻。见图1～2。
2.4 BALF中SP-A浓度的变化
与A组各时间点相比，B组BALF中SP-A浓度下降明显(P < 0.01)，C组与B组各时间点相比，SP-A浓度明显增高(P < 0.05或P < 0.01)。见表1。
2.5 肺泡巨噬细胞胞浆IL–18的表达变化
免疫组化结果示：B组各时间点测得肺单核巨噬细胞中IL-18吸光度A组明显升高(P < 0.05或P < 0.01)，IMD1-53干预后，C组IL-18吸光度下降显著(P < 0.05或P < 0.01)。见表1。
3 讨论
本研究采用尾静脉注射脂多糖诱发ALI的模型，动物致伤后，病理显示，肺组织结构受损，大量炎症细胞浸润，肺 W/D比值增加，PaO2进行性下降，BALF中SP-A浓度逐渐减少，肺单核巨噬细胞合成IL-18明显增加，均提示 ALI的存在，且随致病时间的延长，损伤呈逐步加重的趋势。运用外源性IMD1-53对其进行干预处理后，大鼠急性肺损伤程度明显减轻，与急性肺损伤组比较差异有统计学意义，提示IMD1-53在急性肺损伤早期可发挥保护作用。
SP-A是由肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)合成、分泌的，对于维持肺泡的正常结构与功能起着重要作用。肖燕等[8]证实BALF中SP-A 的含量在ALI后1 h 就出现明显降低，并在6h内维持较低水平。有实验证实在BALF 中 ALI患者比正常低50%～70%[9]，其原因可能是由于肺损伤引起 Ⅱ型上皮细胞肿胀、脱落，大量炎症细胞侵入，释放大量氧自由基、细胞因子及蛋白水解酶，破坏增加，生成减少，从而造成 SP-A 含量降低[10-11]。同时由于肺泡毛细血管膜通透性增高，造成血管内大分子和 PS的双向渗漏，导致 SP-A降解增加[12]。生成减少和丢失严重是造成急性肺损伤BALF中SP-A浓度显著减少的主要原因。Lin和Ware等[13-14]认为SP-A可作为反映ALI/ARDS后Ⅱ型细胞功能的早期指标，也是判断患者肺损伤程度和预后的指标。本实验BALF中SP-A浓度变化与上述实验结果相符，同时IMD1-53干预后SP-A浓度升高明显，说明IMD1-53在急性肺损伤早期可通过抑制SP-A的减少发挥保护作用，但具体机制到目前仍不十分明确，可作为我们今后研究的新方向。
IL-18 是新近发现的一种炎性细胞因子，属于IL-1β超家族，IL-1的特征样结构主要由活化的肺脏单核巨噬细胞产生。IL-18可以诱导炎症早期细胞因子的产生，如TNF-α、IL-1β等，这些细胞因子进一步促进下游的细胞因子产生，如IL-8、巨噬细胞炎性蛋白 -1α(MIP-1α)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等[15]。IL-18和多种炎性因子造成的炎症瀑布效应导致ALI的发生和发展[16]。近期研究亦表明，ARDS 患者的死亡率与患者IL-18水平呈正相关[17] ......
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