喉癌组织的蛋白质组学比较研究(2)
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参见附件。
将以上的分析与喉高分化鳞癌和低分化鳞癌相结合，与癌旁正常黏膜组织进行了2-DE比较，并将三组中斑点位置清晰的图像分别进行合成和分析。
2 结果
2.1 双向凝胶电泳结果
如图A所示，图像显示出现低分化癌组中有7个特异表达或表达上调超过3倍的蛋白点，其高、低分化喉癌组织和癌旁正常黏膜组织的大部分蛋白斑点分子量均位于20.1~116 kD及pI 4~8的区域。在高分化癌组中有6个特异表达或表达上调超过3倍的蛋白点出现，位于30～80 kD及pI 4.5～7.5区域中的蛋白质斑点分布非常密集，呈现3块合成胶的表现。将两组进行两两比较之后，发现高分化癌组与正常组的平均匹配率为70.1%，蛋白斑点数约为600～950之间，蛋白质斑点清晰可辨。
如图B所示，运用PD-quest7.0软件分析3组凝胶图。①喉组织的高低分化两组的pH极酸和极碱性蛋白质的含量均较少，有两个蛋白点的位置基本相同；高、低分化癌组中均有特异表达；低分化癌组与正常组的平均匹配率为71.9%。②正常组平均检测的蛋白点为(606±65)，在高分化癌组中有4个特异表达或表达上调的蛋白点。
将喉癌高低分化组织中共同的特异性标志物与癌旁正常黏膜组织相比：高低分化癌组中均有5个特异表达或表达上调的蛋白点，结合肉眼观察得出；低分化癌组平均检测的蛋白点为(832±49)个，高分化癌组的平均检测蛋白点(846±57)个。
2.2 蛋白质点的鉴定结果
在相同的实验条件和参数的情况下，从差异蛋白质斑点中分辨最清楚的蛋白点上选取一对组织中表达相差3倍以上的点，然后在喉癌及正常黏膜组织凝胶图像中进行标记，重复三次操作，以酶自降解峰进行校正，然后对5对组织中具有相同变化的蛋白点处进行切取并进行MALDI-TOF-MS分析，结果视为差异蛋白质点。最后将所获得的肽质量指纹图以空白胶作阴性对照，软件识别其有效肽片段峰后查询数据库，获得了肽质量指纹图。差异表达蛋白质的生物学功能初步分析获得蛋白质分子量及等电点，与网上的双向凝胶电泳数据库对比分析发现，组中与数据库中基因存在相似的位点。见表1。
3 讨论
随着科学的高速发展，人类的基因组全序列测定理论和技术也得到了长足的发展和完善，近年来，后基因组时代的功能基因组学发展迅速，能从组织或细胞蛋白质的整体和动态水平的全新角度来研究疾病的发病机制[3]。而作为功能基因组学重要内容之一的蛋白质组学(proteomics)[4]也被广泛应用于人类疾病的发病机制、治疗和药物筛选的研究之中，并取得了可喜的成果。而蛋白质组学研究的迅速发展，源于双向凝胶电泳技术[5]的创立和有效运用，其对组织成分的复杂性及人体的个体差异的独特分析作用，已被作为当前分离组织细胞蛋白质组的核心技术来运用，在细胞系的研究发展史上起到关键性作用[6]。
本实验对组织标本的选取及对样量进行了多次的摸排的研究，使其重复性大大增加。在样品制备和双向胶的制备以及考染过程等尽量保持统一性，最终获得了高分化、低分化喉癌组织及癌旁正常黏膜组织等三种组织中固相pH梯度2-DE图谱，而且图像清晰、分辨率高和具有极高的重复性,可反复试验。
样本的收集和处理实验过程中由于蛋白质的样品会被特异组织蛋白质污染，要想获得图像清晰、分辨率高和重复性好的2-DE图谱则需要做好样本的收集和处理，以避免受到污染而影响实验结果[7]。需要特别注意的是新鲜组织样本取得之后，一定要用滤纸吸干样本上表面所黏附的水分，在样本清洗滤干后，应立即去除其他组织，并用生理盐水彻底洗去表面的血液及黏液，以免发生组织蛋白降解和结构破坏的现象。
样品的制备中减少分离步骤因为盐的浓度过高会降低等电聚焦的电压，其蛋白质样品的制备是2-DE中最为关键的一步，甚至会损坏IPG胶条破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用；而降解酶的活性会造成2-DE获取的直接失败，所以为了避免蛋白质在抽提过程中被丢失和破坏，处理这一步的结果好坏会直接影响到2-DE图谱的显示。提取样品蛋白质过程中使其处于完全变性状态，应尽可能提高样品的溶解度，必须考虑除去影响蛋白质可溶性和2-DE重复性的物质，样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。所以，抽提最大量的总蛋白，常常会释放出各种蛋白酶和蛋白质修饰的酶类，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子，以及加蛋白酶抑制剂等，会明显减少蛋白质的损失。所以，实验应尽量在低温下进行，以避免大分子的存在阻塞凝胶孔径，以达到减少对蛋白质的人为修饰的目的。
在样品数量增加的时候，除了会引发双向电泳图谱的畸变外，影响2-DE的结果。蛋白质具有凝集和沉淀的特点，而这些特点则会造成丰度较高的点，特别是在第一向电泳的时候会更加明显。如果再加大以上样品量时能够增加凝胶上点的数目，以至进行第二向的电泳时，当样品量过大时则会出现丰度高的蛋白质点掩盖丰度低的蛋白质点的现象，最后从而产生2-DE图谱上水平和垂直的条纹。
在上样量为1 mg总蛋白时，会导致2-DE图谱上的分辨率下降，只有这样才会在第一向电泳完毕后才能够获得清晰、分辨率高和重复性好的2-DE图谱。另外，需在IPG胶条在第二向电泳平衡两次后，测定样品蛋白质的浓度。
每次15 min的双向凝胶间的界面精密接触时，其水的纯度对染色结果会造成明显的影响，表现为在第一次平衡时会出现减少电内渗的现象，不能单纯缩短平衡的时间，否则会出现接触不好或两者之间有气泡的出现，所以遇到这个问题时，需使用去离子水(电导<2 s)的方法进行解决，以利于蛋白从第一向到第二向的转移，从而影响到一部分蛋白从IPG胶条转移到SDS胶的效率，最后达到在转移时分子行扩散的目的。加入碘乙酰胺在第二次平衡的步骤中，需保证所有的染色器皿绝对干净，其染色过程中也需避免直接用手接触凝胶。解决这个问题需备用一次性手套或无粉乳胶手套；另外，所有的化学试剂一定要分析纯(AR)，并且尽量使用进口的试剂，以除掉多余的DTT(考染过程中，DTT会导致点拖尾)，以便更好地在实验中确保2-DE图谱的质量。
比较肿瘤组织与正常组织中的蛋白质在表达数量的差异时，对喉癌和喉正常组织进行了三次重复性2-DE实验。实验结果发现，寻找与癌变机制相关蛋白的关键就是寻找与癌变相关的特异蛋白质和获得分辨率较高的组织参考图谱，而发现肿瘤分子标记的有效途径就是重复蛋白斑点数目的匹配率需在85%以上。
以癌旁正常的黏膜组织作为对照物，因为高分化与低分化喉癌的图谱之间存在较好的可比性。在2-DE实施分离和可视化的蛋白质数量多少能局部反映组织蛋臼质组的改变，代表了喉癌与正常组织的差异性。本研究运用了目前蛋白质组学研究中所使用的进行蛋白质分离纯化技术中最为常用的一种技术——2-DE技术，充分运用其作用机制，通过调节固相的pH梯度干胶条的等电点区间或应用大面积SDS-PAGE胶，能同时分离展示细胞或组织中成百上千的蛋白质，从而最终达到进一步提高差异蛋白质点的分析和鉴定目的，并能通过一向等电聚焦使不同的蛋白质按等电点聚集的特性，最后使更多的蛋白质得到较为清晰和高分辨率的展现，局部地反映部分组织蛋白质组的改变 ......
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