蜕膜NK细胞KIR的基因分型与原因不明习惯性流产发病机制的研究(2)
1.3.2 盐析法抽提DNA在上述获得的单个核细胞悬液中加裂解液破坏细胞膜,裂解30 min后离心二次再加入表面活性剂蛋白酶K消化蛋白,然后再加入20% SDS和6 M NaCl充分沉淀,最后用氯仿-酚抽提,无水乙醇清洗沉淀DNA。1.3.3 PCR-SSP方法检测蜕膜KIR参照文献[4],合成特异性引物,经BLAST验序正确后,用PCR/SSP方法对蜕膜KIR进行基因位点低分辨率检测和单倍型分析。序列特异性引物聚合酶链反应(sequence specific primer polymerase chain reaction,PCR.SSP)检测蜕膜组织KIR基因,反应体系20 μL,含dNTP终浓度2 mmoL/L,MgCI2 2 mmol/L,引物终浓度214.3 nmol/L。反应条件:96℃ 1 min,96℃ 25 s,65℃ 45 s,72℃ 30 s,5个循环;96℃ 25 s,60℃ 45 s,72℃ 30秒,21个循环;96℃ 25秒,55℃ 1 min,72℃ 2 min,5个循环;72℃ 10 min。以KIR框架基因3DL2、3DL3、2DL4为内参照 ......
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