云南省个旧市女性宫颈HPV感染及基因分型的研究
[摘要] 目的 分析云南省个旧市妇女HPV感染状况，探讨HPV感染与宫颈病变程度的关系。 方法 用导流杂交基因分型技术对2 058例有性生活妇女的宫颈脱落细胞标本进行21种HPV基因分型检测。 结果 2 058例标本中有20种HPV亚型被检测出，HPV总感染率为23.9%，高危型占76.0%，低危型占24.0%，检出前五位亚型依次为HPV52、16、58、18和CP8304。宫颈病变组HPV感染率、高危型HPV及HPV16亚型感染率显著高于病理检查正常组，且随宫颈病变程度的加重感染率显著增高(P < 0.05)。 结论 个旧市妇女HPV感染率为23.9%，高危型HPV尤其是HPV16可能是导致宫颈病变的主要型别。
[关键词] 人乳头瘤病毒(HPV)；宫颈病变；基因分型
[中图分类号] R730.261[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701(2012)12-0001-03
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在全球妇女肿瘤中仅次于乳腺癌，位居第2位。HPV感染与宫颈肿瘤的发生、发展密切相关，高危型HPV的持续性感染是导致宫颈癌及癌前病变的主要致病因子，约20种以上的HPV亚型与宫颈癌的形成有关，且不同的地区、不同的种族HPV的感染率和亚型分布有所不同，导致宫颈病变的发生及病变程度有所差异。因此明确HPV在特定地区及不同病变宫颈组织的感染率及亚型分布差异，对HPV所致疾病的防治及HPV疫苗开发应用有着重要的指导意义。为了解云南省个旧市HPV感染状况及亚型分布规律，本研究采用导流杂交基因芯片技术对2 058例妇科首诊人群的宫颈脱落细胞标本进行21种HPV基因分型检测，探讨HPV亚型感染与宫颈病变发生发展的关系，为本地区宫颈癌的预防、高危人群筛查和特异性疫苗的研制提供一定的实验依据。
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1 对象与方法
1.1 研究对象
2 058例标本取自2010年6月～2011年9月我院妇科首诊患者，年龄19～75岁，平均(40.5±9.1)岁。患者纳入标准：①未行子宫切除手术；②就诊时处于非妊娠状态；③就诊前48 h内无性生活；④就诊前24 h内无阴道处理。所有研究对象均知情同意并自愿参加。按病理确诊结果分为病理检查正常组(354例)、慢性宫颈炎组(77例)，宫颈上皮内瘤变组(包括CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ)(44例)和宫颈癌组(16例)。
1.2 方法
1.2.1 标本采集及保存由医生以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用棉签擦去宫颈分泌物，然后使用专用的HPV采样刷置于宫颈口2~3 cm，顺时针旋转3~5圈，慢慢取出宫颈刷，将其放入有专用细胞保存液的样本管中，折断多余的刷柄，拧紧瓶盖，注明编号和日期。置于4℃存放，并在一周内完成检测。
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1.2.2 HPV分型①DNA提取：取保存有宫颈细胞的细胞保存液0.5 mL，以14000 r/min离心5 min，弃上清液后，用DNA提取试剂盒提取标本DNA。②PCR扩增：PCR反应体系为25 μL，包含：23.25 mL PCR-Mix，0.75 μL DNATaq酶，1 μL DNA模板。凯普基因扩增仪扩增程序为：95℃预变性9 min；95℃20 s→55℃30 s→72℃30 s共40个循环，72℃延伸5 min。③杂交过程：导流杂交前，将PCR扩增产物热变性95℃ 5 min，然后冰水浴≥2 min，同时将固定有核酸探针的膜固定在杂交仪上，加入0.8 mL杂交液预杂交≥2 min后排干，加入0.5 mL杂交液，把PCR产物加到薄膜上与杂交液混匀，进行导流杂交≥10 min，清洗除去未结合的DNA，整个杂交过程保持在45℃。预封阻后用封阻液封闭膜，孵育5 min，排出封阻液后加入酶标液，25 ℃温育3.5 min。④显色过程：用A液彻底冲洗膜，除去未结合的酶标液后，加入NBT/BCIP底物显色3～5 min后B液洗膜3次，蒸馏水清洗后1 h内分析结果。通过导流杂交技术一次检测HPV共21个HPV亚型，包括高危组15个亚型：16、18、31、33、35、39、45、5l、52、53、56、58、59、66和68型；低危组6个亚型：CP8304、6、ll、42、43和44型。
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1.2.3 统计学方法采用SPSS 11.0统计软件处理，组间比较采用χ2检验，P﹤0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 HPV分型结果图
导流杂交膜上内对照点和Biotin对照点必需为阳性，阴性对照均不显色。HPV单一感染时，在导流杂交膜芯片上相应HPV亚型探针位点处可见一蓝紫色斑点，双重或多重感染时，在膜上可见2个或2个以上显色斑点。见图1、2、3。
2.2 HPV感染状况分析
2 058例标本经HPV基因分型诊断筛查出491例HPV感染阳性，HPV感染率为23.9%，各组HPV感染率见表1。不同宫颈疾病HPV检出率差异有统计学意义，宫颈有病变组HPV感染率显著高于病理检查正常组，且随宫颈病变程度的加重，HPV感染率逐渐增高。
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2.3 HPV亚型检出频率分析
所检测的21种HPV亚型除43型外均有检出，491例HPV感染阳性患者中高危型感染占76.0%(373/491)，其中以HPV52亚型检出率最高，其他主要亚型依次为HPV16、58、18型；低危型感染占24.0%(118/491)，以HPVCP8304亚型检查率最高，见图4。
2.4 HPV亚型与宫颈病变相关性分析
高危型HPV感染率尤其是HPV16亚型在不同宫颈病变中的检出率有统计学意义，宫颈有病变组高危型HPV及HPV16亚型感染率显著高于病理检查正常组，且随宫颈病变程度的加重感染率显著增高。见表2、3。
2.5 HPV单一感染和多重感染与宫颈病变程度相关性分析
491例HPV感染阳性标本中检出多重感染111例，占22.6%。其中1例感染型别数高达9种。但各组间多重感染与宫颈病变差异无统计学意义，见表4。
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3讨论
宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤，是全球范围内女性第二大常见恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌。近年来，中国宫颈癌的发生有明显上升和年轻化趋势，发病以每年2～3%的速度增长，有报道指出，99.7%的宫颈癌患者可检测出HPV病毒[1]。HPV感染与宫颈肿瘤的发生、发展密切相关，高危型HPV的持续性感染是导致宫颈癌及癌前病变的主要致病因子，约20种以上的HPV亚型与宫颈癌的形成有关，低危亚型感染仅诱发生殖器疣样病变。女性一生中随着年龄的不同，生殖道HPV感染的概率及亚型不同，不同区域HPV感染亚型也不一。因此，筛查是现阶段预防和控制子宫颈癌的主要手段，只要定期进行高危型HPV的检查，做到早预防、早诊断、早治疗，就可以有效减少妇女死于宫颈癌的概率。中国地域辽阔，不同地区及民族宫颈癌的主要感染型别不尽相同。云南省个旧市是流动人口较多生活环境较复杂的老工业城市，因此明确一个地区HPV致癌的主要型别，可根据感染型别预测病变进展，指导临床医生制定合理诊治方案，为评估预后，避免过度诊断及治疗提供依据。这种地区间的差异提示，为获得最佳的预防效果，HPV疫苗最好能结合当地的HPV流行情况来设计。
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HPV感染具有显著的地域和人群差异。在我们所研究的个旧市妇女人群中HPV感染率为23.9%，与徐州地区女性HPV感染率(26.02%)[2]接近，高于金华地区[4]女性HPV感染率(13.6%)，但比武汉地区(64.5%)、绍兴地区(51.54%)、宁波地区(49.4%)、粤东地区(48.3%)都低[4-7]。同时研究发现HPV感染率随宫颈病变程度的加重逐渐增高，从病理检查正常组的19.3%增至宫颈癌组的88.9%，再次证实了HPV感染与宫颈病变及其宫颈癌的发生、发展密切相关。亚型分析本地区HPV感染以HPV52、16、58、18、CP8304为主要感染型别，其中HPV52(23.8%)在所有受检人群中感染的阳性率最高，与文献[8-9]报道一致，但与我国新疆地区[10]报道以HPV16为主不同。已发现的HPV亚型约100多种，其中近40种可以感染人类的生殖器官，约20种以上的HPV亚型与宫颈癌的形成有关，且不同亚型HPV对宫颈上皮的致病性不同，如低危亚型感染仅诱发生殖器疣样病变，而高危型HPV持续感染被认为是宫颈癌及其癌前病变发生的主要因素。我们的研究显示，宫颈有病变组高危型HPV尤其是HPV16亚型感染率显著高于病理检查正常组，且随宫颈病变程度的加重感染率有增加趋势，说明高危型HPV尤其是HPV16亚型感染在宫颈病变发展中的重要作用。多项研究认为多重HPV感染发生宫颈癌的危险性比单一感染高，但本研究中各宫颈病变组的多重HPV感染并无明显差异，可能与样本量较少有关，也可能与人群及地域有关，我们将在今后的研究中扩大样本规模进行进一步研究。
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综上所述，个旧市妇女人群HPV感染率为23.9%，多为高危型感染，主要感染型别依次为HPV52、16、58、18、CP8304，高危型HPV尤其是HPV16可能是导致宫颈病变的主要致病型别，为本地区HPV所致疾病的防治及针对性HPV疫苗开发应用提供了重要的理论依据。
[参考文献]
[1]周毅. 人类乳头瘤病毒与宫颈癌的相关调查[J]. 中华医院感染学杂志，2004，2(3)：129-130.
[2]王淑贞，王金锋，王静，等. 徐州地区女性宫颈感染人乳头瘤病毒基因亚型分析[J]. 放射免疫学杂志，2009，22(6)：627-629.
[3]蒋旭峰，蒋群芳. 金华地区女性感染人乳头瘤病毒基因类型分析[J].放射免疫学杂志，2009，22(1)：85-87.
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[4]胡兴文. 武汉地区宫颈感染人乳头状瘤病毒基因分析[J]. 实用医技杂志，2007，14(14)：1831-1832.
[5]吴满武. 妇科门诊518例就诊者宫颈拭子HPV检测结果分析[J]. 中国优生与遗传杂志，2009，17(4)：77-79.
[6]喻明，毛燕君. 宁波地区1670例育龄妇女人乳头瘤病毒感染阳性率的凋查[J]. 中国优生与遗传杂志，2009，17(5)：137-138.
[7]林广玲，翁建盛，林小荣，等. 粤东地区妇女下生殖道HPV亚型的基因芯片检测与分析[J]. 江西医学检验，2006，24(4)：303-305.
[8]余南，辜为为，刘红娥，等. 广州东部HPV基因型分布及其势基因型E6/E7核酸序列分析[J]. 中国人兽共患病学报，2009，25(3)：220-225.
[9]罗招云，杨立业. 潮州地区人乳头瘤病毒型别分布特征分析[J]. 分子诊断与治疗杂志，2011，3(3)：177-180.
[10]阿依努尔·买买提，佐合拉古丽·木塔力甫，古扎丽努尔·阿不力孜，等. 新疆维、汉族宫颈腺癌与HPV各类型关系的研究[J]. 新疆医科大学学报，2009，32(5)：518-521.
(收稿日期：2012-01-09), http://www.100md.com(倪兵 朱顺挥 史文娟 赵芸 谷庆节 马继云 张明 段能)
[关键词] 人乳头瘤病毒(HPV)；宫颈病变；基因分型
[中图分类号] R730.261[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701(2012)12-0001-03
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在全球妇女肿瘤中仅次于乳腺癌，位居第2位。HPV感染与宫颈肿瘤的发生、发展密切相关，高危型HPV的持续性感染是导致宫颈癌及癌前病变的主要致病因子，约20种以上的HPV亚型与宫颈癌的形成有关，且不同的地区、不同的种族HPV的感染率和亚型分布有所不同，导致宫颈病变的发生及病变程度有所差异。因此明确HPV在特定地区及不同病变宫颈组织的感染率及亚型分布差异，对HPV所致疾病的防治及HPV疫苗开发应用有着重要的指导意义。为了解云南省个旧市HPV感染状况及亚型分布规律，本研究采用导流杂交基因芯片技术对2 058例妇科首诊人群的宫颈脱落细胞标本进行21种HPV基因分型检测，探讨HPV亚型感染与宫颈病变发生发展的关系，为本地区宫颈癌的预防、高危人群筛查和特异性疫苗的研制提供一定的实验依据。
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1 对象与方法
1.1 研究对象
2 058例标本取自2010年6月～2011年9月我院妇科首诊患者，年龄19～75岁，平均(40.5±9.1)岁。患者纳入标准：①未行子宫切除手术；②就诊时处于非妊娠状态；③就诊前48 h内无性生活；④就诊前24 h内无阴道处理。所有研究对象均知情同意并自愿参加。按病理确诊结果分为病理检查正常组(354例)、慢性宫颈炎组(77例)，宫颈上皮内瘤变组(包括CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ)(44例)和宫颈癌组(16例)。
1.2 方法
1.2.1 标本采集及保存由医生以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用棉签擦去宫颈分泌物，然后使用专用的HPV采样刷置于宫颈口2~3 cm，顺时针旋转3~5圈，慢慢取出宫颈刷，将其放入有专用细胞保存液的样本管中，折断多余的刷柄，拧紧瓶盖，注明编号和日期。置于4℃存放，并在一周内完成检测。
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1.2.2 HPV分型①DNA提取：取保存有宫颈细胞的细胞保存液0.5 mL，以14000 r/min离心5 min，弃上清液后，用DNA提取试剂盒提取标本DNA。②PCR扩增：PCR反应体系为25 μL，包含：23.25 mL PCR-Mix，0.75 μL DNATaq酶，1 μL DNA模板。凯普基因扩增仪扩增程序为：95℃预变性9 min；95℃20 s→55℃30 s→72℃30 s共40个循环，72℃延伸5 min。③杂交过程：导流杂交前，将PCR扩增产物热变性95℃ 5 min，然后冰水浴≥2 min，同时将固定有核酸探针的膜固定在杂交仪上，加入0.8 mL杂交液预杂交≥2 min后排干，加入0.5 mL杂交液，把PCR产物加到薄膜上与杂交液混匀，进行导流杂交≥10 min，清洗除去未结合的DNA，整个杂交过程保持在45℃。预封阻后用封阻液封闭膜，孵育5 min，排出封阻液后加入酶标液，25 ℃温育3.5 min。④显色过程：用A液彻底冲洗膜，除去未结合的酶标液后，加入NBT/BCIP底物显色3～5 min后B液洗膜3次，蒸馏水清洗后1 h内分析结果。通过导流杂交技术一次检测HPV共21个HPV亚型，包括高危组15个亚型：16、18、31、33、35、39、45、5l、52、53、56、58、59、66和68型；低危组6个亚型：CP8304、6、ll、42、43和44型。
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1.2.3 统计学方法采用SPSS 11.0统计软件处理，组间比较采用χ2检验，P﹤0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 HPV分型结果图
导流杂交膜上内对照点和Biotin对照点必需为阳性，阴性对照均不显色。HPV单一感染时，在导流杂交膜芯片上相应HPV亚型探针位点处可见一蓝紫色斑点，双重或多重感染时，在膜上可见2个或2个以上显色斑点。见图1、2、3。
2.2 HPV感染状况分析
2 058例标本经HPV基因分型诊断筛查出491例HPV感染阳性，HPV感染率为23.9%，各组HPV感染率见表1。不同宫颈疾病HPV检出率差异有统计学意义，宫颈有病变组HPV感染率显著高于病理检查正常组，且随宫颈病变程度的加重，HPV感染率逐渐增高。
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2.3 HPV亚型检出频率分析
所检测的21种HPV亚型除43型外均有检出，491例HPV感染阳性患者中高危型感染占76.0%(373/491)，其中以HPV52亚型检出率最高，其他主要亚型依次为HPV16、58、18型；低危型感染占24.0%(118/491)，以HPVCP8304亚型检查率最高，见图4。
2.4 HPV亚型与宫颈病变相关性分析
高危型HPV感染率尤其是HPV16亚型在不同宫颈病变中的检出率有统计学意义，宫颈有病变组高危型HPV及HPV16亚型感染率显著高于病理检查正常组，且随宫颈病变程度的加重感染率显著增高。见表2、3。
2.5 HPV单一感染和多重感染与宫颈病变程度相关性分析
491例HPV感染阳性标本中检出多重感染111例，占22.6%。其中1例感染型别数高达9种。但各组间多重感染与宫颈病变差异无统计学意义，见表4。
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3讨论
宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤，是全球范围内女性第二大常见恶性肿瘤，发病率仅次于乳腺癌。近年来，中国宫颈癌的发生有明显上升和年轻化趋势，发病以每年2～3%的速度增长，有报道指出，99.7%的宫颈癌患者可检测出HPV病毒[1]。HPV感染与宫颈肿瘤的发生、发展密切相关，高危型HPV的持续性感染是导致宫颈癌及癌前病变的主要致病因子，约20种以上的HPV亚型与宫颈癌的形成有关，低危亚型感染仅诱发生殖器疣样病变。女性一生中随着年龄的不同，生殖道HPV感染的概率及亚型不同，不同区域HPV感染亚型也不一。因此，筛查是现阶段预防和控制子宫颈癌的主要手段，只要定期进行高危型HPV的检查，做到早预防、早诊断、早治疗，就可以有效减少妇女死于宫颈癌的概率。中国地域辽阔，不同地区及民族宫颈癌的主要感染型别不尽相同。云南省个旧市是流动人口较多生活环境较复杂的老工业城市，因此明确一个地区HPV致癌的主要型别，可根据感染型别预测病变进展，指导临床医生制定合理诊治方案，为评估预后，避免过度诊断及治疗提供依据。这种地区间的差异提示，为获得最佳的预防效果，HPV疫苗最好能结合当地的HPV流行情况来设计。
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HPV感染具有显著的地域和人群差异。在我们所研究的个旧市妇女人群中HPV感染率为23.9%，与徐州地区女性HPV感染率(26.02%)[2]接近，高于金华地区[4]女性HPV感染率(13.6%)，但比武汉地区(64.5%)、绍兴地区(51.54%)、宁波地区(49.4%)、粤东地区(48.3%)都低[4-7]。同时研究发现HPV感染率随宫颈病变程度的加重逐渐增高，从病理检查正常组的19.3%增至宫颈癌组的88.9%，再次证实了HPV感染与宫颈病变及其宫颈癌的发生、发展密切相关。亚型分析本地区HPV感染以HPV52、16、58、18、CP8304为主要感染型别，其中HPV52(23.8%)在所有受检人群中感染的阳性率最高，与文献[8-9]报道一致，但与我国新疆地区[10]报道以HPV16为主不同。已发现的HPV亚型约100多种，其中近40种可以感染人类的生殖器官，约20种以上的HPV亚型与宫颈癌的形成有关，且不同亚型HPV对宫颈上皮的致病性不同，如低危亚型感染仅诱发生殖器疣样病变，而高危型HPV持续感染被认为是宫颈癌及其癌前病变发生的主要因素。我们的研究显示，宫颈有病变组高危型HPV尤其是HPV16亚型感染率显著高于病理检查正常组，且随宫颈病变程度的加重感染率有增加趋势，说明高危型HPV尤其是HPV16亚型感染在宫颈病变发展中的重要作用。多项研究认为多重HPV感染发生宫颈癌的危险性比单一感染高，但本研究中各宫颈病变组的多重HPV感染并无明显差异，可能与样本量较少有关，也可能与人群及地域有关，我们将在今后的研究中扩大样本规模进行进一步研究。
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综上所述，个旧市妇女人群HPV感染率为23.9%，多为高危型感染，主要感染型别依次为HPV52、16、58、18、CP8304，高危型HPV尤其是HPV16可能是导致宫颈病变的主要致病型别，为本地区HPV所致疾病的防治及针对性HPV疫苗开发应用提供了重要的理论依据。
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[1]周毅. 人类乳头瘤病毒与宫颈癌的相关调查[J]. 中华医院感染学杂志，2004，2(3)：129-130.
[2]王淑贞，王金锋，王静，等. 徐州地区女性宫颈感染人乳头瘤病毒基因亚型分析[J]. 放射免疫学杂志，2009，22(6)：627-629.
[3]蒋旭峰，蒋群芳. 金华地区女性感染人乳头瘤病毒基因类型分析[J].放射免疫学杂志，2009，22(1)：85-87.
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[4]胡兴文. 武汉地区宫颈感染人乳头状瘤病毒基因分析[J]. 实用医技杂志，2007，14(14)：1831-1832.
[5]吴满武. 妇科门诊518例就诊者宫颈拭子HPV检测结果分析[J]. 中国优生与遗传杂志，2009，17(4)：77-79.
[6]喻明，毛燕君. 宁波地区1670例育龄妇女人乳头瘤病毒感染阳性率的凋查[J]. 中国优生与遗传杂志，2009，17(5)：137-138.
[7]林广玲，翁建盛，林小荣，等. 粤东地区妇女下生殖道HPV亚型的基因芯片检测与分析[J]. 江西医学检验，2006，24(4)：303-305.
[8]余南，辜为为，刘红娥，等. 广州东部HPV基因型分布及其势基因型E6/E7核酸序列分析[J]. 中国人兽共患病学报，2009，25(3)：220-225.
[9]罗招云，杨立业. 潮州地区人乳头瘤病毒型别分布特征分析[J]. 分子诊断与治疗杂志，2011，3(3)：177-180.
[10]阿依努尔·买买提，佐合拉古丽·木塔力甫，古扎丽努尔·阿不力孜，等. 新疆维、汉族宫颈腺癌与HPV各类型关系的研究[J]. 新疆医科大学学报，2009，32(5)：518-521.
(收稿日期：2012-01-09), http://www.100md.com(倪兵 朱顺挥 史文娟 赵芸 谷庆节 马继云 张明 段能)