IGF—ⅠR抑制剂联合西妥昔单抗对人肝癌细胞的体外抑制作用(2)
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参见附件。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
西妥昔单抗与IGF—ⅠR抑制剂aIR3均购自德国默克制药公司，CCK—8细胞计数试剂盒产自日本同仁化学研究所，RPMI—1640细胞培养液、10%新生小牛血清、含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的双抗、0.25%胰酶溶液购自美国Gibco公司，分析纯二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司。
1.2 细胞培养
人肝癌细胞株HepG2购自中科院上海细胞所，细胞培养液为含10%小牛血清、含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI—1640培养液，置于37℃、5%CO2、85%湿度的恒温培养箱中培养，每3～4天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。
1.3 细胞生长抑制实验
分为5组，包括空白对照组、细胞对照组、西妥昔单抗组、aIR3组、aIR3与西妥昔单抗联合组，每组含3个复孔。HepG2细胞通过0.25%胰酶溶液消化，用RPMI—1640培养液稀释并接种于96孔培养板，调整细胞密度达3×104/mL，置于恒温箱中培养。两药单用时剂量分别为西妥昔单抗(5～500) mg/mL，aIR3(2.5～250.0) μmol/L，详见表1，2。两药联用时，按上述药物剂量保持固定比例，详见表3。分别培养24 h，48 h，72 h，通过酶标仪测定各组吸光度值(A值)，并计算各组细胞增殖抑制率。
1.4 统计学方法
根据药物协同作用中效原理，计算各组抑制率均数，经生物软件CalcuSyn计算不同时间点、不同浓度的两药联合作用于HepG2细胞的协同系数(combination index，CI)。
2 结果
2.1 西妥昔单抗对HepG2细胞的作用
单药西妥昔单抗对HepG2细胞有明显抑制作用，且呈显著的时间依赖性与浓度依赖性，随药物浓度增加与作用时间延长其抑制作用也显著增强，见表1、图1。作用72 h后其最大增殖抑制率为42.2%。
2.2 aIR3对HepG2细胞的抑制作用
aIR3以时间与浓度依赖性方式抑制HepG2细胞的增殖，见表2、图2。培养72 h后其最大增殖抑制率达82.3%。
2.3 西妥昔单抗联合aIR3对细胞的抑制作用
西妥昔单抗联合aIR3可显著抑制HepG2细胞的增殖，其抑制率较单药显著升高，作用72 h后，其最大增殖抑制率达91.8%，见表3、图3。
2.4 西妥昔单抗与aIR3的协同作用系数
利用CalcuSyn软件计算两药不同浓度在各时间点的CI值，结果显示各时间点的CI值均小于1，提示西妥昔单抗与aIR3可协同抑制HepG2细胞的增殖，见表4。
3 讨论
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其治疗仍以外科手术为首选，但手术后易于复发转移，传统的化疗和放疗疗效不佳，极大地影响了其疗效与预后[5]。近年来分子靶向治疗技术的飞速发展则为肝癌提供了一个新的治疗途径，EGFR抑制剂则是最受关注的领域之一。EGFR在许多恶性肿瘤中过高表达，并且EGFR高表达的恶性肿瘤患者预后较差。肝癌细胞中也常有表皮生长因子受体的表达，并与肝癌患者的临床分期、肝内外转移及组织分化程度等有关[6]。西妥昔单抗是一种人—鼠嵌合抗EGFR IgG1 MAb，属于作用于胞外区的单克隆抗体，已被批准用于治疗依立替康复发的转移性结肠癌，对肝癌的抑制作用亦有文献报道。IGF—ⅠR广泛表达于多种类型的细胞表面，对正常细胞的生物学行为有着极其重要的作用，当其表达过度时，细胞可以向恶性表型转化。在多种肿瘤中均已检测到IGF—ⅠR及其配体的表达异常。以IGF—ⅠR为靶点的实验研究也屡见报道。胰岛素样生长因子Ⅰ型受体单克隆抗体аIR3对肿瘤的抑制作用已有不少报道[7]，但аIR3与西妥昔单抗联合应用抑制肝癌细胞增殖尚未见文献报道。
在本研究中，西妥昔单抗与аIR3作用于人肝癌细胞株HepG2细胞72 h后，其最大增殖抑制率分别为42.2%、82.3%，二药联合作用于HepG2细胞72 h后，最大抑制率达91.8%。西妥昔单抗与аIR3不同浓度在各时间点的CI值均小于1，表明二药合用对HepG2细胞的增殖有显著的协同抑制作用。研究表明，西妥昔单抗与EGFR特异性结合后，通过增加细胞周期抑制因子p27kip 的表达，诱导细胞停留于G1期，从而抑制细胞增殖；通过增加凋亡促进基因Bax表达和减少凋亡抑制基因bcl —2表达而诱导肿瘤细胞凋亡[8]。有文献报道，aIR3可通过阻滞细胞周期、诱导凋亡等途径抑制肝癌细胞增殖。还有报道，aIR3除可抑制IGF— I R功能及其下游受体丝氨酸/苏氨酸Akt的磷酸化，还可降解IGF— I R。aIR3封闭IGF— I R，在体外可消除IGF— I R促增殖、抑制凋亡的作用，从而抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，达到治疗目的[9] ......
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