细针吸取细胞学结合PCR法在淋巴结结核诊断中的应用及其与传统微生物检测方法的比较(2)
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参见附件。
1.1.2 仪器与试剂 LightCycler PCR扩增仪为美国罗氏公司产品；PCR试剂为中山大学达安基因股份有限公司产品；抗酸染色液为珠海贝索生物技术有限公司产品。
1.2 方法
1.2.1 标本的采集 肿块局部皮肤常规消毒，采用10 mL一次性注射器(针头22G)，左手固定肿块，右手保持负压在肿块内反复多方向提插数次，去负压，分离针头针筒，拔出针头，将吸出物打在载玻片上，涂片24张，一张稍干燥用于抗酸染色，其余立即用95%乙醇固定，然后HE染色镜检。用细胞学剩余材料或重新穿刺材料进行PCR扩增及结核杆菌培养
1.2.2 PCR法检测TB—DNA 将穿刺标本用无菌生理盐水洗涤2次，取50 μL沉渣悬液加50 μL lDNA提取液充分混匀，置100℃沸水浴中10 min，取出后置4℃，6～8 h以保证充分裂解。10000 rpm离心5 min，取上清液2 μL加入专用毛细管中，4000 rpm离心3 min，插入圆形卡盘倒置20 s后放入仪器中设置循环条件为93℃，2 min预变性，然后经93℃，5 s；57℃，45 s，共40个循环，37℃延伸1 min。另取阴性质控品、阳性质控品各40μL加等量DNA提取液打匀，沸水浴10min后同上处理。反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光记数值为F1/F2，点击Quantification读取结果。以Ct(Cycle threshold)值判断结果，Ct值<40为阳性，Ct值≥40为阴性。
1.2.3 抗酸染色法找抗酸杆菌 按照试剂说明书进行。主要步骤如下：(1)初染：涂片上滴加石碳酸复红液，用火焰加热至产生蒸汽，约5 min(防止染液蒸干)，水洗。(2)脱色：第二液(3%盐酸乙醇)脱色约1 min，轻轻摇动玻片至涂片无红色脱出或略显粉红色时为止，水洗。(3)复染：第三液(吕氏美蓝复染液)复染30 s，水洗。自然干燥后镜检。抗酸杆菌染成红色，非抗酸杆菌为蓝色。
1.2.4 结核杆菌细菌培养 (1)前处理：视标本性状，加1～2倍体积4%氢氧化钠(NaOH)消化液于标本瓶中，涡旋振荡器振荡2～3 min，使标本充分匀化，室温放置。(2)接种：吸取经前处理后的标本0.1 mL，均匀接种在整个培养基斜面。每份标本接种两支酸性罗氏培养基。接种后，37℃平卧放置斜面24 h。然后拧紧培养瓶盖或塞紧试管胶塞，直立放置，37℃继续培养。(3)结果与报告：接种后第3天、第7天各观察1次。3 d发现菌落生长者，经抗酸染色证实后，可报告快速生长抗酸杆菌。以后每周观察1次，记录菌落生长及污染情况。阳性生长物经抗酸染色证实后，可报告抗酸杆菌生长。培养阴性结果须在满8周时即第9周开始时仍未见菌落者方可报告。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0软件包进行统计学处理。不同检测方法阳性率的比较采用卡方检验。
2 结果
细针穿刺细胞学((Fine needle aspiration cytology，FNAC)诊断结核的主要依据是涂片中找到干酪样坏死物、朗罕细胞和类上皮细胞，若三者同时见于淋巴结穿刺涂片，即可诊断淋巴结结核[2]。本组162例，FNAC直接诊断淋巴结结核61例，占37.7%，其它101例可见肉芽肿性病变或坏死性病变，诊断为可疑结核或不排除结核，进一步病原学检查阳性和/(或)伴有肺部病灶、PPD实验阳性及抗结核治疗有效。
162例穿刺涂片抗酸染色，涂片通过1000倍油镜仔细查找，发现染成紫红色棒状，弯曲杆状细菌为阳性，见图3，抗酸杆菌可散在数条或小簇散布。162例抗酸染色阳性71例，阳性率43.8%。穿刺物PCR扩增结核分枝杆菌TB—DNA，电脑自动判读结果，阳性病例可见扩增曲线见图4，TB—DNA阳性117例，阳性率为72.2%。结核杆菌培养需特殊培养基，菌落生长似奶酪，见图5。细菌培养阳性99例，阳性率为61.1%。各项病原学检测结果与FNAC诊断结果的对比见表1。
表1 162例结核FNAC诊断与抗酸染色、细菌培养、PCR检测结果的比较
可见在FNAC明确诊断的病例，PCR及细菌培养阳性率明显高于抗酸染色(χ2值均为13.739，P < 0.01)，在101例FNAC未直接诊断结核的病例，PCR阳性率高于细菌培养及抗酸染色(χ2值分别为6.706、13.612，P均<0.01)。另外71例涂片找到抗酸杆菌的病例细菌培养及PCR结果均阳性，而99例细菌培养阳性的病例TB—DNA均阳性。FNAC直接诊断淋巴结结核的61例，占37.7%，FNAC结合PCR结果可明确诊断结核的为131例，占80.9%。
根据FNAC镜下所见可分为增殖型：呈肉芽肿样改变，可见小巢和散在杵状、黄瓜状上皮样细胞和/(或)郎罕细胞(图1)。有反应性淋巴细胞，未见干酪样坏死组织；增殖伴坏死型：在增殖型涂片基础上可见不同数量淡染嗜伊红的无定形物质；干酪样坏死型：见大量淡染嗜伊红的坏死组织或水样坏死无定形物(图2)。背景中可见残存的淋巴细胞，伴发感染时可见多量中性粒细胞。其各项病原学检测结果见表2。从表2可见抗酸染色，细菌培养及PCR检测结果阳性率在没有坏死的增殖型明显低于坏死型及伴有坏死的增殖型(χ2值分别为6.786，13.183，13.739，P均 < 0.01)，而三者阳性率在增殖坏死型及干酪样坏死型间无明显差异(χ2值分别为2.973，2.981，3.001，P均>0.05)。
表2 FNAC分型与抗酸染色、细菌培养、PCR检测结果的关系[n(%)]
3 讨论
由于人类艾滋病病毒和耐药结核菌株的产生等原因，全球结核病疫情明显上升并呈持续上升趋势[3]。世界卫生组织于2006年发起防治结核病全球计划 ......
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