PI3K/Akt抑制剂联合西妥昔单抗对人肺癌细胞的体外抑制作用(2)
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参见附件。
1 材料与方法
1.1 实验材料
Cetuximab与PI3K/Akt抑制剂LY294002均购自德国默克制药公司，DMEM细胞培养液、10%新生小牛血清、含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的双抗、0.25%胰酶溶液购自美国Gibco公司，分析纯二甲基亚砜(DMSO)和3—(4，5—二甲基噻唑—2)—2，5—二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自美国Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1细胞培养 人肺癌细胞株A549购自中科院上海细胞所，细胞培养液为含10%小牛血清、含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2、85%湿度的恒温培养箱中培养，每3～4天传代1次，取对数生长期细胞进行实验。
1.2.2 单药对细胞生长抑制实验 设空白对照组、细胞对照组和单药实验组；单药实验组即Cetuximab处理组和LY294002处理组，每组设3个复孔。取对数生长期的A549细胞，经0.25%胰酶溶液充分消化后，用DMEM培养液稀释成单细胞悬液，接种于96孔培养板，细胞密度为3×104/mL，置于恒温箱中培养。两药单用时各选取5个依次递增的浓度(1、5、25、125、625 nmol/L Cetuximab，5、10、20、40、80 μmol/L LY294002)处理细胞，分别培养48 h。之后每孔加入5 mg/mL MTT液20 μL，37℃、5%CO2饱和湿度下继续培养4 h后，弃去孔内上清，每孔加150 μL DMSO，震荡10 min使沉淀充分溶解，酶标仪570 nm波长下测定吸光度OD值(A)，并计算细胞增殖抑制率和半数抑制浓度IC50值。实验重复3次，取平均值。
1.2.3 两药不同联合方式对细胞生长抑制实验 设空白对照组、细胞对照组和联合实验组；联合实验组包括：LY294002和Cetuximab同步联合处理组(即LY294002+C—225)，Cetuximab→LY294002序贯处理组(即C—225→LY294002)，LY294002→Cetuximab序贯处理组(即LY294002→C—225)，每组设3个复孔。根据单药在1.2.2中获得的IC50值，确定两药联用时的比例和浓度。分别采用组合浓度的1/10、1/5、1、2、5倍作用于细胞，加入孔内的药物浓度递增的同时两药间浓度比例保持恒定。之后同1.2.2所述，经MTT检测后应用全自动酶标仪测定各孔吸光度值(A值)，并计算细胞增殖抑制率和IC50。实验重复3次，取平均值。
1.2.4 计算和统计学方法 ①各组细胞存活率(%)=(该药物处理组A值—空白对照组A值)/(细胞对照组A值—空白对照组A值)×100%；②细胞增殖抑制率(%)=100%—该组细胞存活率。统计学处理根据Chou等药物协同作用中效原理[7]，使用SPSS 13.0软件计算Cetuximab和LY294002在单独、同步联用和不同序贯方式联用时对A549细胞的IC50值(50% inhibition concentration，半数抑制浓度)。根据IC50值计算协同系数(combination index，CI)。CI值是评价两种药物之间相互作用的指标，特别是两药各自在IC50时的CI值，是衡量其相互作用的性质和强度的客观指标。CI=D1/Dx1+D2/Dx2+αD1D2/ Dx1 Dx2，其中D1、D2为两药合用时产生x效应时两药各自所需浓度，Dx1、Dx2为两药单独使用时产生x效应时两药各自浓度。α=0为两种相互排斥性药物，α=1为两种相互非排除性药物。两药联用时CI>1为拮抗，CI=1为相加，CI<1为协同，CI值越小，协同效应越强。
2 结果
2.1 单药Cetuximab对A549细胞的作用
单药Cetuximab对A549细胞有明显抑制作用，且呈显著的浓度依赖性，随药物浓度增加其抑制作用也显著增强，作用48 h最大抑制率达(57.3±6.2)%，见表1。作用48 h的IC50值为187.20 nmol/L。
2.2 单药LY294002对A549细胞的作用
单药LY294002对A549细胞增殖的抑制作用呈明显的浓度依赖性，作用48 h后其最大抑制率达(56.2±6.0)%，见表1。作用48 h的IC50值为47.13 μmol/L。
2.3 LY294002和Cetuximab同步联合组对A549细胞的作用 ......
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