PI3K/Akt抑制剂联合西妥昔单抗对人肺癌细胞的体外抑制作用(3)
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2.5 LY294002→Cetuximab序贯处理组对A549细胞的作用
LY294002处理48 h后，Cetuximab再处理48 h的序贯处理组不同浓度对应的细胞增殖抑制率如表2，在5倍浓度时其最大抑制率达(84.9±7.5)%(表2)。LY294002和Cetuximab的IC50的浓度分别为8.84 μmol/L和35.37 nmol/L，此时CI值为0.41，说明LY294002→Cetuximab序贯处理表现为协同效应，且协同效应高于LY294002和Cetuximab同步联合组和Cetuximab→LY294002序贯处理组。
表2 LY294002和Cetuximab不同联用方式对A549细胞的作用
3 讨论
PI3K/Akt通路被认为是癌细胞存活的首要通路，有“抗凋亡途径”之称。该信号转导通路的异常，可导致细胞异常增殖引起肿瘤[8]。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，与v—src和v—ras等癌基因的产物相关，PI3K介导的信号转导通路调节细胞的分裂、分化、凋亡等活动[9]。Akt是PI3K下游直接的靶蛋白，其具有丝氨酸/苏氨酸残基，可直接被PI3K激活，也可以被PI3K激活的PDK1和PDK2所激活。p—Akt是Akt的功能活化状态，Akt 只有在活化状态时才具有生物学功能[10]。p—Akt在大多数肿瘤组织中过度表达，在非小细胞肺癌患者中发现p—Akt总表达率为67.4%，在鳞癌和腺癌中的表达率分别为68.2%和61.5%，因此PI3K/Akt通路可能是参与肺癌发生发展的重要途径[11]。
肿瘤细胞可以通过对负责细胞生长和凋亡的细胞信息转导通路进行调控(如Akt通路的激活)而获得对化疗药物的抵抗力。Akt是抑制细胞凋亡和诱导凋亡化疗药物敏感性的中枢介质。PI3K /Akt通路的激活已被认为是肿瘤细胞抗凋亡的主要机制之一，因此抑制P13K可作为抑制肿瘤生长的一种新思路。LY294002是五羟黄酮的衍生物，能完全特异性地抑制PI3K活性，能和PI3K 竞争性结合ATP位点， 抑制Akt的激活。体外实验发现，LY294002对结肠癌细胞、卵巢癌细胞、黑色素瘤细胞等有抑制生长、促进凋亡作用[12—15]。本研究发现LY294002 可抑制A549 细胞增殖， 且随着LY294002浓度的增大生长抑制率也随之增大，说明通过抑制PI3K/Akt基因的表达从而调整细胞增殖与凋亡间的平衡，可能是肺癌靶向治疗的新思路。
EGFR是生长因子家族的重要成员之一，广泛分布于人体正常肝细胞、胃肠黏膜上皮细胞、成纤维细胞等表面[16]。EGFR与配体EGF等结合后，自身磷酸化而激活，并启动下游一系列级联酶促信号转导通路，最重要的通路之一就是PI3K/Akt通路[17]。恶性肿瘤发病原因复杂，是一种由多因素通过复杂网络相互作用所致的疾病，因此多靶点抑制在恶性肿瘤治疗方面优于单靶点抑制，多靶点联合阻断信号传导是肿瘤治疗和药物开发新的发展方向。由于EGFR在PI3K/Akt通路中起着重要作用，因此，我们认为EGFR抑制剂与PI3K/Akt抑制剂的联用可能会为肺癌的靶向治疗提供新的思路。西妥昔单抗是一种人—鼠嵌合抗EGFR IgG1 MAb，属于作用于胞外区的单克隆抗体，可以阻断EGF和TGF—α与EGFR的结合。体外实验表明，C—225能抑制人NSCLC细胞株的生长，与细胞毒药物如顺铂或与放疗联合有协同抑制作用[18]。
我们的研究结果表明，EGFR抑制剂Cetuximab和PI3K/Akt抑制剂LY294002同步联用时，IC50值低于单用时的IC50值，CI值<1(CI=0.73)。Cetuximab→LY294002序贯处理组中两药IC50值与同步联用时的IC50值接近，CI值<1(CI=0.88)，略大于同步联用时的CI值。LY294002→Cetuximab序贯处理组中两药IC50值低于单用、同步联用和Cetuximab→LY294002序贯处理组的IC50值，且CI值<1(CI=0.41)。根据Chou等药物量效原理：两药联用时CI>1为拮抗，CI=1为相加，CI<1为协同，CI值越小，协同效应越强，说明Cetuximab与LY294002同步联用和以不同顺序序贯联用时均表现为协同效应，且以给药序贯为LY294002先于Cetuximab给药时两者的协同效应最为明显(CI=0.41)。西妥昔单抗和LY294002联合应用时二者具有明显的协同效应的分子机制可能是LY294002在西妥昔单抗抑制EGFR信号通路转导的基础上，进一步下调了EGFR信号转导通路的下游PI3K/Akt通路中关键酶PI3K和Akt的表达，两药联用从上游和下游两个层次上阻断EGFR的活化，从而协同抑制了EGFR对A549细胞增殖的促进作用 ......
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