肺炎克雷伯菌对β—内酰胺类抗生素耐药性主决定因素的研究(2)
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参见附件。
1 材料与方法
1.1 标本
收集2009年5月～2011年12月在我院门诊临床送检的痰液、咽拭子、气管分泌物等并制成标本铺在血平板上，置于37℃，约12～24 h，在一般情况下培养，再将培养的肺炎克雷伯菌接种于细菌药敏板条及生化板条，24 h后观察结果。根据实验结果分为3组：①敏感菌组，对所有抗生素均敏感的肺炎克雷伯菌62株；②多重耐药组，对部分抗生素耐药的肺炎克雷伯菌66株；③泛耐药组，对所有抗生素均耐药的肺炎克雷伯菌63株。
1.2 β—内酰胺酶活性测定
将肺炎克雷伯菌接种于MH琼脂平皿中，培养基含有氨苄西林45 mg/L的terrificbroth 5～7 mL，37 ℃10 h，接种于含氨苄西林50 mg/L的terrific broth培养基1000 mL，37℃12 h，至其光密度达OD600=0.9(对数生长后期)。Lowry法测定β—内酰胺酶蛋白含量。利用Perkin—Elmerλ2紫外/可见分光光度计进行时间动态扫描测定，时间间隔0.1 min，波长490 nm，湿度25 ℃，底物为0.2 mmol/L的nitrocefin pH 7.0，在规定条件下使底物吸光度每分钟增高1A的β—内酰胺酶活性为1个单位(U)。根据单位蛋白重量测定计算每株菌的β—内酰胺酶的活性[3]。运用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)进行分析，不同菌株之间进行差异比较。
1.3 细胞膜通透性测定
在Terrific Broth各组菌株培养24 h，按1∶50接种于新鲜的Terrific Broth，37 ℃，2～3 h，OD600=0.9，4℃，4 000 g离心，6 min后开始收集菌体，在 pH为7.0情况下，用10 mL的100 mmol/L PBS洗涤1次， 其次将菌体悬浮于5 mL的PBS溶液中，置于冰块中留以备用。把上面的菌体悬浮液加入到96孔微孔板中，共加入36个孔，每个孔0.05 mL，其中18孔加入2.5%的辛基聚环氧乙烷各0.01 mL，另外18孔加缓冲液各0.01 mL，再加入抗生素溶液0.01 mL，抗生素溶液呈系列稀释，37℃，5 min后，加入0.1 mmol/L nitrocefin的磷酸钠缓冲液，0.1 mL含5%的O—POE，测定β—内酰胺酶活性[4]。
1.4 统计学分析
所得数据采用SPSS 17.0统计软件，计量资料采用以均数±标准差(x±s)表示，多组间计量资料比较采用方差分析，两组间比较用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
与敏感菌株组β—内酰胺酶活性比较，泛耐药菌株组β—内酰胺酶活性、多重耐药菌株组β—内酰胺酶活性均明显增多，差异有统计学意义(P < 0.05)，而泛耐药菌株组β—内酰胺酶活性表达最高。与敏感菌株组细胞外膜通透性比较，泛耐药菌株组细胞外膜通透性、多重耐药菌株组细胞外膜通透性具有明显的阻碍作用，差异有统计学意义(P < 0.05)，而泛耐药菌株组细胞外膜通透性阻碍作用最强。见表1。
表1 三组菌株β—内酰胺酶活性、外膜不通透性测定
注：与敏感菌株组比较，aP < 0.05；与泛耐药菌株组比较，bP < 0.05；t = 3.35为敏感菌株组与泛耐药菌株组比较，t = 2.85为多重耐药菌株组与泛耐药菌株组比较，t = 6.74为敏感菌株组与泛耐药菌株组比较，t = 4.78为多重耐药菌株组与泛耐药菌株组比较。
3 讨论
肺炎克雷伯菌在普通培养基上就可以生长，其本身没有鞭毛夹膜很厚是革兰氏隐性球杆形细菌，并且其生长所需要的营养不是很高，菌落呈现黏液状而且比较大，环挑菌株易拉成丝为特征[5，6]。肺炎克雷伯菌是人类肠道和呼吸道的常见菌、致病菌，可引起手术切口、泌尿道、呼吸道、血液、肠道等多个部位感染炎症[7]。
近年来肺炎克雷伯菌感染有明显上升的趋势，但是由于各种抗菌药物的广泛使用，从呼吸道检出肺炎克雷伯氏菌耐药性较高，这给临床医治上造成了一定压力。研究表明，不同菌株内的β—内酰胺酶的活性有很大区别，细菌对β—内酰胺类抗生素的耐药性与β—内酰胺酶水平成正比关系。本研究也证实了这一点，研究结果可以看出，与敏感菌株组(A组)β—内酰胺酶活性比较，泛耐药菌株组(B组)β—内酰胺酶活性和多重耐药菌株组(C组)β—内酰胺酶活性均明显增多，差异显著，有统计学意义(P < 0.05)；而泛耐药菌株组β—内酰胺酶活性表达最高。泛耐药菌株的β—内酰胺酶活性最强说明β—内酰胺酶活性是反映耐药性的一个重要因素。主要是因为广谱β—内酰胺酶可通过细菌间基因的转化、扩散、转导、接合，造成治疗上的困难和院内感染的多发[8，9]，主要是因为一个菌株具备了耐药性，使细菌耐药性基因不断传播。
从菌株的细胞膜的通透性来看，与敏感菌株组细胞外膜通透性比较，泛耐药菌株组细胞外膜通透性、多重耐药菌株组细胞外膜通透性具有明显的阻碍作用，差异有统计学意义(P < 0.05)。而泛耐药菌株组细胞外膜通透性阻碍作用最强。可见敏感菌株通透性最好，泛耐药菌株细胞膜通透性较差，细胞外膜通透性阻碍作用最强。细菌在生长的过程中是通过其附着结构或鞭毛牢固地附着在固体表面 ......
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