益母草碱对阿霉素致斑马鱼心脏毒性保护作用的初步研究(1)
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[摘要] 目的 观察不同浓度的盐酸益母草碱对阿霉素所致斑马鱼胚胎心脏毒性的保护作用。 方法 应用发育正常受精后48 h的斑马鱼胚胎作为实验模型，用盐酸益母草碱+阿霉素(浓度为0+30 mg/L，30 mg/L+30 mg/L，60 mg/L+30 mg/L，120 mg/L+30 mg/L)处理上述胚胎，分别于受精后60 h、72 h和96 h时观察胚胎心脏的形态及心率的变化。 结果 各给药组以及对照组在给药后均出现心率减慢、心脏区域出血的胚胎心脏中毒现象。但益母草碱联合用药组的心脏毒性作用较小，且随着盐酸益母草碱浓度的升高，阿霉素的心脏毒性作用明显减小。 结论 阿霉素对斑马鱼胚胎具有心脏毒性作用，而盐酸益母草碱对阿霉素所致心脏毒性具有保护作用。
[关键词] 盐酸益母草碱；阿霉素；斑马鱼；心脏毒性
[中图分类号] R99 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2013)04-0010-02
斑马鱼(zebrafish)是新近兴起的一种理想的模式生物，与其他模式生物相比，它的胚胎透明而且是体外发育，繁殖快，很容易观察药物及基因干预后对活体器官，具有基因敲除小鼠等大模式动物不具备的很多优点[1]。抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也导致人体正常组织、器官的损伤，特别是对心脏的毒性反应。心率是体现心脏功能的一个重要指标，对心率的记录可以比较直观反应某一药物的心脏毒性[2]。本实验利用新型模式生物斑马鱼，通过阿霉素构建心脏毒性模型，观察盐酸益母草碱对斑马鱼阿霉素心脏毒性的保护作用，为临床心脏毒性抗肿瘤药物的安全使用以及心脏毒性作用的降低提供初步研究资料。
1 材料与方法
1.1实验动物
野生型斑马鱼(AB系)来自于华中科技大学，养殖系统从美国AquaticHabitats公司引进。养殖根据zebrafish book中描述的方法进行，交配前雌雄分开饲育，照明/黑暗14 h/10 h交替，定时喂料，获取胚胎时，将5条雌鱼15条雄鱼(雌∶雄=1∶3)混合，收集的胚胎培养于28.5℃隔水式培养箱中，培养大约 20 h(21个体节阶段)后显微镜下挑出健康的胚胎，按形态特征区分发育阶段，及时挑出死亡胚胎和幼鱼，超过24 h的胚胎经0. 003 g/L苯硫脲(PTU)处理防止黑色素的形成，以方便观测。受精卵按照Westerfield描述对发育阶段分期[3]。
1.2 仪器及试剂
阿霉素(Adriamycin，ADR，购于上海阿拉丁试剂有限公司，纯度>98%)，盐酸益母草碱(Leonurine hydrochloride，LH，购于武汉福鑫化工有限公司，纯度>98%)，斑马鱼胚胎培养液(参照Zebrafish book标准，0.137 mol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，0.25 mmol/L Na2HPO4，1.3 mmol/L K2HPO4，1.3 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgSO4，4.2 mmol/L NaHCO3)，PBS缓冲液，体视显微镜(上海长方化学仪器有限公司，XTZ-D型)。其他试剂均为国产分析纯。
1.3 方法
1.3.1 试剂配制 阿霉素以及盐酸益母草碱用二甲基亚砜(DMSO)助溶，将其配成贮存液，避光置于-20℃冰箱，实验时再以胚胎培养液稀释到所需浓度(实验组药物浓度：盐酸益母草碱+阿霉素=0+30 mg/L，30 mg/L+30 mg/L，60 mg/L+30 mg/L，120 mg/L+30 mg/L)。另设空白组(含0.1%DMSO的胚胎培养用水，不加阿霉素)以及对照组(含0.1%DMSO的胚胎培养用水，30 mg/L阿霉素，不加盐酸益母草碱)。
1.3.2 胚胎处理方法 根据预实验设定阿霉素浓度为30 mg/L，96孔板的样孔中预先加入各实验组溶液。再挑选发育48 h胚胎为模型，随机放入样孔中，每个实验组20个胚胎。随后于光照培养箱中恒温(28.5℃)孵育，并分别于施药后12 h， 24 h，48 h观察并记录各实验组胚胎的心脏形态、循环系统血流、心率等指标。为尽量减少实验误差，以上实验重复3遍，所用胚胎为同一批受精胚胎。
1.4 统计学分析
本研究采用重复测量的方差分析，比较斑马鱼个体心率随时间的变化及各用药组间的变化，应用SPSS 13.0软件进行处理，计量资料以(x±s)表示，多组数据比较采用方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
体视显微镜下观察，实验组和对照组的斑马鱼胚胎，处理12 h、24 h、48 h后，斑马鱼心率较空白组减慢(表1)。但对照组胚胎心脏区域出现心膜出血症状，心跳微弱，血液循环受阻，血细胞在心区堆积(图1，2，3)，随着时间的延长药物的作用持续，到48 h后心脏形态线性化，心囊水肿，血液循环停止，心跳微弱以至停止。而实验组中胚胎心脏区域出血症状以及心率较对照组有明显改善，且这种改善与盐酸益母草碱浓度正相关。
以空白组为参照，采用重复测量的方差分析 ......
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