慢性乙肝患者外周血Treg/Th17及相关细胞因子的变化(1)
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[摘要] 目的 检测慢性乙肝患者外周血Treg/Th17及相关细胞因子水平，探讨其与慢性乙肝发病的关系。 方法 选择30例慢性乙肝患者为观察组，另选择30例健康志愿者为对照组。采用流式细胞术检测两组外周血中Treg细胞和Th17细胞频数，并检测其相关的细胞因子IL-17、IL-23、IL-10及TGF-β1水平。 结果 研究组外周血Treg细胞频数和Th17细胞频数显著高于对照组，而Treg/Th17显著低于对照组，差异均有统计学意义(P < 0.05或<0.01)。研究组IL-10、TGF-β1及IL-23水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.01或<0.05)。而重度患者TGF-β1水平和Treg/Th17显著高于轻中度患者，差异有统计学意义(P < 0.01)。 结论 慢性乙肝患者外周血Treg细胞和Th17细胞均明显升高，而两者的失衡在疾病的发生发展过程中发挥了重要的作用。
[关键词] 慢性乙肝；Treg细胞；Th17细胞；细胞因子
[中图分类号] R512.6+2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2013)04-0108-03
慢性乙肝已成为全球医疗界的难题，我国是慢性乙肝的高发区。据统计，携带HBV病毒者大约有1/4的感染者发展为慢性肝炎；约有4.4%和15%的慢性肝炎患者最终发展为肝细胞癌和肝硬化。目前认为，HBV 感染后疾病的不同表现、转归及临床过程与机体的免疫状态有关，T细胞在清除和抑制病毒感染中发挥重要的作用[1]。而慢性乙肝患者的T细胞功能的缺陷与Treg细胞(调节性T细胞)升高有关。辅助性T细胞(T helper lymphocytes，Th)在免疫应答过程中发挥重要作用。Th17是近年来发现的不同于Th1和Th2细胞的亚群，与自身免疫反应具有密切的相关性[2]。正常情况下，Treg/Th17保持平衡有利于维持机体免疫状态的稳定。当两者比例失衡后，可导致一系列的免疫炎症反应。本文主要是探讨慢性乙肝患者外周血Treg/Th17细胞水平状态以及与疾病的发病是否存在相关性。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2012年1～6月在我院进行治疗的慢性乙肝患者30例作为研究组，其中男18例，女12例，年龄23～57岁，平均(31.7±11.4)岁。其中轻度5例，中度16例，重度9例。小三阳16例，大三阳14例。入选标准：①诊断明确；②入组前3个月没有使用影响免疫的药物；③入组3个月没有进行保肝和抗病毒治疗。排除标准：① 其他类型的病毒性肝炎或酒精性肝炎、药物性肝炎；②自身免疫性疾病；③原发性肝癌 ；④代谢性肝病。对照组为在我院进行健康体检的志愿者，共30名。其中男15名，女15名，年龄20～55岁，平均(32.5±12.1)岁。两组的性别、平均年龄比较差异无统计学意义(P > 0.05)，具有可比性。
1.2 检测方法
1.2.1采血方法 清晨抽取肘静脉血8 mL，分置于2支采血管中。1支3 mL肝素抗凝，离心后分离外周血单个核细胞，进行Treg细胞和Th17细胞频数检测。另1支采血管静置后分离血浆进行细胞因子及血生化检测。
1.2.2 Th17细胞频数检测 采用美国BD公司FACS Calibur双激光四色分选流式细胞仪进行检测。采用RPMI-1640 细胞培养基(上海江莱生物科技有限公司)将收集到的外周血单个核细胞调配到细胞密度为2×106/mL，取2mL加入到6孔板内，再分别加入佛波酯(北京中西远大科技有限公司)、离子霉素(上海叶舟生物科技有限公司)、莫能菌素(山东胜利生物工程有限公司)，37℃培养5h。收集细胞于测定管和对照管中，每个管中100 μL。每个管中分别加入20 μL的CD8-PE和10 μL的CD3-PC5单克隆抗体，室温下避光孵育15 min。然后室温下固定液100μL进行固定反应15 min，加入PBS(上海抚生实业有限公司)缓冲液3mL，混匀后，离心，弃上清。破膜剂100μL进行细胞打孔，IL-17-FITC 20 μL加入测定管中，对照管中加入20 μL同型对照。室温下孵育20 min后，加入PBS缓冲液3 mL，混匀后静置10 min，弃上清，加入PBS 0.5mL重新悬浮，进行检测。
1.2.3 Treg细胞频数检测 静脉血100 μL，加入20 μL CD4-FITC和20 μL CD127-PE单克隆抗体，10 μL CD25-PC5单克隆抗体，避光下孵育20 min，加入红细胞裂解液2 mL，避光下孵育20 min，加PBS缓冲液3mL洗涤，后加入PBS缓冲液0.5 mL重新悬浮，进行检测。
1.2.4 细胞因子的检测 采用ELISA法进行检测，主要检测血浆中IL-17、IL-10、IL-23及TGF-β1 ......
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