来曲唑通过cAMP—PKA信号通路影响子宫肌瘤细胞中MMP—2和TIMP—2的表达(2)
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1.2.4 Western blot 处理时间结束后，收集各实验组细胞，加入500 μL蛋白裂解液裂解细胞30 min，提取各组细胞的总蛋白。BAC法按试剂盒说明进行操作，测定裂解液蛋白质的浓度。取50 μg蛋白样本加入2×SDS加样缓冲液中，煮沸，充分变性蛋白质。6%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h而分离蛋白，电泳电压为80 mV。将分离的蛋白转膜至聚偏氟乙稀膜上，然后采用丽春红染色法观察蛋白转移效果，并确定蛋白分子量标准的位置。用5%脱脂牛奶在室温下孵育膜2 h，将非特异性抗原封闭。分别加入兔抗人MMP-2(1：150)、TIMP-2(1：150)和β-actin(1：200)的抗体，4℃下过夜。用TBST洗膜3次，每次洗5 min。加入羊抗兔二抗，二抗用辣根过氧化物酶标记，4℃下孵育膜4 h，然后用TBST冲洗3次。按照试剂盒说明书的指导，采用蛋白质印迹检测试剂盒将蛋白质条带显示于X光片上，采用凝胶图像分析系统扫描胶片并对结果进行半定量分析。
1.3 统计学处理
采用SPSS 16.0统计学软件分析数据。实验数据均采用x±s表示，采用单因素方差分析比较组间差异；组间差异的两两比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 来曲唑对人子宫肌瘤细胞中MMP-2和TIMP-2表达的影响
来曲唑(10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L)处理人子宫肌瘤细胞48 h或来曲唑(10-6 mol/L)处理人子宫肌瘤细胞24、48和72 h后，采用实时定量PCR和Western blot分别检测人子宫肌瘤细胞中MMP-2和TIMP-2 mRNA和蛋白的表达。结果如表1、表2和图1所示 ......
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