柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达(2)
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参见附件。
取重组菌破菌沉淀，加8 mol/L(pH8.0)尿素10 mL重悬，4℃裂解过夜；离心收集上清用于纯化，纯化按Qiagen公司Ni-NTA说明书进行。12% SDS-PAGE分析，BandScan软件分析重组蛋白的纯度。
1.8 小鼠抗CA16病毒血清的制备
将RD细胞接种到培养瓶中，当RD细胞长满80%时，加入CA16病毒悬液，37℃，5%的CO2培养箱中培养4～5 d，收集细胞并反复冻融三次，离心收集病毒悬液并腹腔注射5只BALB/c小鼠，病毒剂量按200 μL/只，共注射3次，每次间隔2周。第3次注射后1周采血，分离血清。
1.9 间接ELISA法检测重组蛋白的抗原性及有效性
将重组蛋白pET21b-CA16 VP1和pET32a用100 mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)以1：200稀释，分别包被于酶标板100 μL/孔，37℃孵育2 h，弃上清；10%的脱脂奶粉37℃封闭2h；每孔加入2倍系列稀释(1：20～1：5120)的小鼠抗CA16 病毒血清和太原市老年人血清100 μL，37℃孵育45 min，PBST洗液洗4次；加入1∶2000稀释的辣根过氧化物酶标记的LD5 100 μL，37℃孵育45 min；PBST洗液洗4次，TMB显色液显色，于450 nm波长处测定吸光度值(A450)。
1.10统计学方法
实验数据使用SPSS17.0软件进行统计学分析，数据符合偏态分布，两组间比较采用两独立样本的秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义 ......
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