新型单羰基姜黄素衍生物B06对不同辐射抗拒鼻咽癌细胞的抑制作用(2)
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养 CNE-2和CNE-2R(抗辐射)细胞株(由中山大学中山医学院病理生理学教研室馈赠)[11]在含有10%小牛血清、100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL链霉素的1640细胞培养液内，于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。
1.2.2 MTT实验 取对数生长期细胞接种至96孔板，100 μL/孔，4×103个细胞/孔，每组设6孔，重复3次，培养24 h根据实验分组换新鲜培养液或含不同浓度药物的培养液100 μL/孔。继续培养48 h后，每孔加20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，37℃、5%CO2培养箱孵育4 h，酶标仪测定490 nm光吸度值(A490)，按公式计算药物对细胞增殖的抑制率：抑制率=[(A490对照-A490用药)/A490对照] ×100%。
1.2.3 Western-blot检测姜黄素及其衍生物对ERS通路相关蛋白的影响 消化收集细胞沉淀，加入RIPA缓冲液裂解细胞，离心取上清。蛋白定量后取50 μg蛋白，10%聚丙烯酞胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)，80 V恒压20 min，140 V恒压电泳3 h。电泳完毕后，采用湿转法，将PAGE胶上的蛋白质至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)1 h，封闭液稀释的一抗(Anti-CHOP、Anti-XBP-1、Anti-ATF-4 ......
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