不同核酸提取方法检测HIV病毒载量和耐药基因的研究(1)
[摘要] 目的 比较5种核酸提取法提取HIV RNA的效率。 方法 收集2015年HIV病毒感染者血样，使用不同核酸提取方法平行检测Ct值及载量值，分析检测的检出率、敏感性、变异系数、稳定性，并进行耐药扩增。 结果 5种提核酸方法检出率国产磁珠法最高，5种方法差异无统计学意义(χ2=7.98，P=0.09)；Ct值从小到大顺序为：国产磁珠法≥离心柱法>大批量法≥进口磁珠法>试剂盒自带法；重复性比较表明国产磁珠法检测结果较稳定；核酸胶显示国产磁珠法提取RNA浓度最高；提取方法不影响耐药关键位点检测。 结论 5种核酸提取方法均能检测HIV信息，国产磁珠法提取病毒核酸进行检测，敏感性和稳定性均较高。
[关键词] 核酸提取；荧光定量PCR；HIV载量；耐药基因；磁珠；HIV RNA
[中图分类号] R512.91 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2016)20-0111-04
[Abstract] Objective To compare the efficiency of HIV RNA extracted by five kinds of nucleic acid extraction methods. Methods Blood samples were collected from HIV infected persons in 2015. Used different methods of nucleic acid extraction to detect the Ct value and the load value. The detection rate， the sensitivity， the coefficient of variation， the stability， and the drug resistance were detected. Results Domestic magnetic bead method had the highest detection rate in five kinds of nucleic acid method， there was no statistically significant difference of 5 kinds of method (χ2=7.98， P=0.09). Ct values from small to large order： domestic magnetic beads≥centrifugal column method>large quantities of extraction method≥imported magnetic beads>phenol/chloroform cracking. Repeatability tests showed that domestic magnetic beads was stable； Nucleic acid gel showed domestic magnetic beads to extract RNA concentration was highest； Extraction method did not affect the detection of drug resistance. Conclusion Five kinds of nucleic acid extraction methods are able to detect HIV information. The viral nucleic acid extraction using magnetic beads method， sensitivity and stability are higher.
[Key words] Nucleic acid extraction； Quantitative PCR； HIV load； Resistance gene； Magnetic beads； HIV RNA
人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)已在全球肆虐40余年。据WHO统计，至2015年底预计有1500万感染者接受抗病毒治疗[1]。根据《艾滋病治疗手册》，规定接受治疗的艾滋病患者必须定期检测病毒载量，用于反映药物疗效以及预防耐药的发生。抗病毒治疗可以降低艾滋病患者血液中的病毒载量，恢复部分免疫功能。但是长期接受抗病毒治疗、患者依从性差等均易导致对治疗药物产生耐药性，继而加剧耐药株的传播。非洲某些地区新发病者耐药性高达15.2%，诸多一线治疗药物失效[2，3]。
目前HIV病毒载量检测一般为RNA，克隆病毒基因片段关键在于高效提取RNA核酸。此外，对基因分型溯源分析、CD4+T细胞受体CCR5Δ32/Δ32、肿瘤循环DNA等研究也要求完整的序列片段[4-6]。核酸RNA模板提取的过程是影响后续试验结果的关键，尤其是对病毒水平较低的样本影响会更明显。基层疾控系统常用的病毒核酸提取方法主要有磁珠法和离心柱法[7，8]，多为进口试剂，进口试剂价格昂贵，近年来，国内基于实时荧光定量技术与不同的核酸提取方法进行研制，凯杰、达安基因、珠海丽珠与万泰生物等率先研发了国内病毒载量检测试剂，自带核酸提取试剂盒。本文选择了市售常见的5种RNA核酸提取方法，对HIV感染者血样进行HIV病毒载量和耐药基因检测比较，旨在评估国产试剂和进口试剂的灵敏性、重复性、核酸回收率，为基层疾病预防控制中心选择适宜的HIV病毒RNA核酸提取方法提供参考数据。现将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本次纳入检测为本地区共80例HIV感染者，其中男59例，女21例，平均年龄37.08岁，经酶联免疫、胶体硒法和蛋白免疫印迹确证。其中58例为2015年7月1日～12月31日新发现的病例，男45例，女13例，未经过治疗；22例为2015年之前发现的病例，经过治疗；全部患者均知情同意。, http://www.100md.com(刘敏 陈秀英 梅少林等)
[关键词] 核酸提取；荧光定量PCR；HIV载量；耐药基因；磁珠；HIV RNA
[中图分类号] R512.91 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2016)20-0111-04
[Abstract] Objective To compare the efficiency of HIV RNA extracted by five kinds of nucleic acid extraction methods. Methods Blood samples were collected from HIV infected persons in 2015. Used different methods of nucleic acid extraction to detect the Ct value and the load value. The detection rate， the sensitivity， the coefficient of variation， the stability， and the drug resistance were detected. Results Domestic magnetic bead method had the highest detection rate in five kinds of nucleic acid method， there was no statistically significant difference of 5 kinds of method (χ2=7.98， P=0.09). Ct values from small to large order： domestic magnetic beads≥centrifugal column method>large quantities of extraction method≥imported magnetic beads>phenol/chloroform cracking. Repeatability tests showed that domestic magnetic beads was stable； Nucleic acid gel showed domestic magnetic beads to extract RNA concentration was highest； Extraction method did not affect the detection of drug resistance. Conclusion Five kinds of nucleic acid extraction methods are able to detect HIV information. The viral nucleic acid extraction using magnetic beads method， sensitivity and stability are higher.
[Key words] Nucleic acid extraction； Quantitative PCR； HIV load； Resistance gene； Magnetic beads； HIV RNA
人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)已在全球肆虐40余年。据WHO统计，至2015年底预计有1500万感染者接受抗病毒治疗[1]。根据《艾滋病治疗手册》，规定接受治疗的艾滋病患者必须定期检测病毒载量，用于反映药物疗效以及预防耐药的发生。抗病毒治疗可以降低艾滋病患者血液中的病毒载量，恢复部分免疫功能。但是长期接受抗病毒治疗、患者依从性差等均易导致对治疗药物产生耐药性，继而加剧耐药株的传播。非洲某些地区新发病者耐药性高达15.2%，诸多一线治疗药物失效[2，3]。
目前HIV病毒载量检测一般为RNA，克隆病毒基因片段关键在于高效提取RNA核酸。此外，对基因分型溯源分析、CD4+T细胞受体CCR5Δ32/Δ32、肿瘤循环DNA等研究也要求完整的序列片段[4-6]。核酸RNA模板提取的过程是影响后续试验结果的关键，尤其是对病毒水平较低的样本影响会更明显。基层疾控系统常用的病毒核酸提取方法主要有磁珠法和离心柱法[7，8]，多为进口试剂，进口试剂价格昂贵，近年来，国内基于实时荧光定量技术与不同的核酸提取方法进行研制，凯杰、达安基因、珠海丽珠与万泰生物等率先研发了国内病毒载量检测试剂，自带核酸提取试剂盒。本文选择了市售常见的5种RNA核酸提取方法，对HIV感染者血样进行HIV病毒载量和耐药基因检测比较，旨在评估国产试剂和进口试剂的灵敏性、重复性、核酸回收率，为基层疾病预防控制中心选择适宜的HIV病毒RNA核酸提取方法提供参考数据。现将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本次纳入检测为本地区共80例HIV感染者，其中男59例，女21例，平均年龄37.08岁，经酶联免疫、胶体硒法和蛋白免疫印迹确证。其中58例为2015年7月1日～12月31日新发现的病例，男45例，女13例，未经过治疗；22例为2015年之前发现的病例，经过治疗；全部患者均知情同意。, http://www.100md.com(刘敏 陈秀英 梅少林等)