MicroRNA—22—3p在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义(1)
[摘要] 目的 探讨MicroRNA-22-3p(miR-22-3p)在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)组织中的表达情况，并分析miR-22-3p与食管鳞状细胞癌临床病理特征、预后之间的关系。 方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应法(qPCR)检测miR-22-3p在77例ESCC组织和癌旁正常组织中的表达差异及其与食管鳞状细胞癌的临床病理特征、预后的相关性。 结果 miR-22-3p不同程度高表达36.4%(28/77)，正常表达20.8%(16/77)，低表达42.8%(33/77)。miR-22-3p相对高表达的患者无病生存期较非高表达患者长(P<0.05)，但miR-22-3p的表达水平与临床病理特征(性别、年龄、肿瘤位置、分化程度、浸润程度、淋巴结转移、TNM分期、肿瘤家族史、吸烟和饮酒)之间均无相关性(P>0.05)。 结论 miR-22-3p在食管癌的发生发展中起着抑癌因子的作用，其高表达能延长食管癌患者的生存时间。
[关键词] miR-22-3p；食管鳞状细胞癌；无病生存期；抑癌因子
[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2016)27-0001-04
肿瘤是发达国家中最主要的死亡原因，在发展中国家位居第二。食管癌的发病率和死亡率在世界范围内位居第六[1]。鳞状细胞癌和腺癌是食管癌的主要病理类型，鳞状细胞癌主要位于食管中上段，占食管癌的90%；其余少部分为腺癌，一般位于食管下段[2]。食管鳞状细胞癌确诊往往已属晚期，侵袭和转移的患者预后不佳。目前仍未发现食管鳞状细胞癌高度特异性标记物，因此早期诊断食管鳞状细胞癌十分困难[3]。微小RNA(microRNA)是一类22nt左右片段大小的、具有高度组织特异性的非编码RNA，对确诊肿瘤的病理类型和起源具有潜在意义[4]。Real-Time PCR可检测食管鳞状细胞癌患者组织中miR-22-3p的相对表达情况，分析miR-22-3p与食管鳞状细胞癌的病理特征和患者预后之间的关系。本文主要研究miR-22-3p的相对表达情况对食管癌的发生、进展及转移的作用及预测功能，为食管鳞状细胞癌的转移潜能和患者预后评估提供理论依据。现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
收集77例ESCC组织及癌旁正常组织，病例来自于2008年2月～2009年11月我院食管癌手术后组织标本(病理科明确诊断食管鳞癌)，女7例，男70例，年龄46～81岁，平均64.4岁。术前未经任何放化疗，排除自身免疫性疾病及严重感染性疾病。癌旁正常组织取自肿瘤边缘5 cm外区域肉眼下正常食管组织；术后标本立即保存于液氮中，并转移至浙江省肿瘤研究所，提取总RNA，转录cDNA后保存于-80℃冰箱待实验用。组织标本TNM分期和分级：高/中分化55例，低分化22例；Ⅰ/Ⅱ期39例，Ⅲ/Ⅳ期38例；伴淋巴结转移44例，无淋巴结转移33例。本研究经医院伦理委员会审批同意，电话随访患者，随访截止时间设定为2013年3月25日。
1.2 试剂
RNA提取试剂盒为Qiagen公司的MirNeasy Mini Kit，Prime ScriptR miRNA cDNA Synthesis Kit(D350A)反转录试剂盒和SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ(DRR 081A)real-time PCR试剂盒均购于TaKaRa公司。实验引物(上海捷瑞)：miR-22-3p：5'-AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-3'，U6：5'-CGCTTCGGCAGCACA-TATAC-3。
1.3 实验方法
1.3.1 提取总RNA 肿瘤组织及对应正常组织的总RNA按照MirNeasy Mini Kit试剂盒说明书提取，总RNA的浓度和纯度由紫外分光光度计检测：A260/A 280范围在1.8～2.1间的样本用于后续实验。
1.3.2 转录RNA 将上述提取总RNA(1 μg)按说明书提供的反应条件设置温度，在PCR仪上进行cDNA的逆转录。
1.3.3 cDNA扩增 ABI 7500PCR仪(Applied Biosystems)分析RT-PCR的PCR扩增及溶解曲线。反应体系20 μL，具体操作按SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ说明书步骤。PCR反应过程：激活聚合酶50 ℃ 2 min，预变性95℃ 30 s；变性95℃ 5 s，退火和延伸60℃ 34 s，40个循环扩增。PCR溶解曲线：95℃ 15 s，60℃ 60 s，85℃ 15 s，60℃ 15 s。设复孔3个取均值计算。按2-△△CT法分析结果：△CT=Ct(miR-22-3p)- Ct(U6)；按△△CT=△CT(癌组织)-△CT(癌旁正常组织)计算miR-22-3p在食管鳞状细胞癌组织和癌旁正常组织中相对表达情况，表达下降：△△CT>1；表达正常：-1≤△△CT≤1；表达升高：△△CT, http://www.100md.com(王江峰 陈晟 凌志强)
[关键词] miR-22-3p；食管鳞状细胞癌；无病生存期；抑癌因子
[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2016)27-0001-04
肿瘤是发达国家中最主要的死亡原因，在发展中国家位居第二。食管癌的发病率和死亡率在世界范围内位居第六[1]。鳞状细胞癌和腺癌是食管癌的主要病理类型，鳞状细胞癌主要位于食管中上段，占食管癌的90%；其余少部分为腺癌，一般位于食管下段[2]。食管鳞状细胞癌确诊往往已属晚期，侵袭和转移的患者预后不佳。目前仍未发现食管鳞状细胞癌高度特异性标记物，因此早期诊断食管鳞状细胞癌十分困难[3]。微小RNA(microRNA)是一类22nt左右片段大小的、具有高度组织特异性的非编码RNA，对确诊肿瘤的病理类型和起源具有潜在意义[4]。Real-Time PCR可检测食管鳞状细胞癌患者组织中miR-22-3p的相对表达情况，分析miR-22-3p与食管鳞状细胞癌的病理特征和患者预后之间的关系。本文主要研究miR-22-3p的相对表达情况对食管癌的发生、进展及转移的作用及预测功能，为食管鳞状细胞癌的转移潜能和患者预后评估提供理论依据。现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
收集77例ESCC组织及癌旁正常组织，病例来自于2008年2月～2009年11月我院食管癌手术后组织标本(病理科明确诊断食管鳞癌)，女7例，男70例，年龄46～81岁，平均64.4岁。术前未经任何放化疗，排除自身免疫性疾病及严重感染性疾病。癌旁正常组织取自肿瘤边缘5 cm外区域肉眼下正常食管组织；术后标本立即保存于液氮中，并转移至浙江省肿瘤研究所，提取总RNA，转录cDNA后保存于-80℃冰箱待实验用。组织标本TNM分期和分级：高/中分化55例，低分化22例；Ⅰ/Ⅱ期39例，Ⅲ/Ⅳ期38例；伴淋巴结转移44例，无淋巴结转移33例。本研究经医院伦理委员会审批同意，电话随访患者，随访截止时间设定为2013年3月25日。
1.2 试剂
RNA提取试剂盒为Qiagen公司的MirNeasy Mini Kit，Prime ScriptR miRNA cDNA Synthesis Kit(D350A)反转录试剂盒和SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ(DRR 081A)real-time PCR试剂盒均购于TaKaRa公司。实验引物(上海捷瑞)：miR-22-3p：5'-AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-3'，U6：5'-CGCTTCGGCAGCACA-TATAC-3。
1.3 实验方法
1.3.1 提取总RNA 肿瘤组织及对应正常组织的总RNA按照MirNeasy Mini Kit试剂盒说明书提取，总RNA的浓度和纯度由紫外分光光度计检测：A260/A 280范围在1.8～2.1间的样本用于后续实验。
1.3.2 转录RNA 将上述提取总RNA(1 μg)按说明书提供的反应条件设置温度，在PCR仪上进行cDNA的逆转录。
1.3.3 cDNA扩增 ABI 7500PCR仪(Applied Biosystems)分析RT-PCR的PCR扩增及溶解曲线。反应体系20 μL，具体操作按SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ说明书步骤。PCR反应过程：激活聚合酶50 ℃ 2 min，预变性95℃ 30 s；变性95℃ 5 s，退火和延伸60℃ 34 s，40个循环扩增。PCR溶解曲线：95℃ 15 s，60℃ 60 s，85℃ 15 s，60℃ 15 s。设复孔3个取均值计算。按2-△△CT法分析结果：△CT=Ct(miR-22-3p)- Ct(U6)；按△△CT=△CT(癌组织)-△CT(癌旁正常组织)计算miR-22-3p在食管鳞状细胞癌组织和癌旁正常组织中相对表达情况，表达下降：△△CT>1；表达正常：-1≤△△CT≤1；表达升高：△△CT, http://www.100md.com(王江峰 陈晟 凌志强)