miRNA—181a在系统性红斑狼疮患者血浆中的表达及临床意义(1)
[摘要] 目的 研究miRNA-181a检测在系统性红斑狼疮患者临床诊治中的价值。 方法 采用反转录PCR法(RT-PCR)检测36例2015年1～6月来我院门诊和住院就诊的系统性红斑狼疮(SLE)患者及30例同期来我院健康体检的对照者的血浆miRNA-181a相对表达量，同时测定SLE患者的血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)与免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和补体C3、C4及系统性红斑狼疮活动指数(SLEDAI)等，分析miRNA-181a与这些临床指标的关系。 结果 SLE组miRNA-181a相对表达水平显著高于健康对照组，SLE活动期组高于SLE稳定期组，差异均有统计学意义(P<0.05)。SLE患者血浆miRNA-181a相对表达水平与血沉、C反应蛋白、SLEDAI评分等呈正相关(r=0.48、0.56、0.62，P均<0.05)。 结论 血浆miRNA-181a浓度在SLE患者体内明显升高，且与SLE患者目前常用的一些临床评估指标高度相关，miRNA-181a有可能成为一个新的SLE疾病活动度评估及预后判断的分子标志物。
[关键词] miRNA-181a；血浆；系统性红斑狼疮；临床指标；反转录PCR
[中图分类号] R593.241 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2016)32-0037-04
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种自身免疫介导的以免疫性炎症为突出表现、常累及多系统、多器官的自身免疫性疾病。SLE病因复杂，发病机制尚不明确，机体的免疫异常被认为是发病的关键原因。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类广泛存在于真核生物中、长度约21～25个核苷酸的非编码小分子RNA。它可通过与靶基因mRNA序列的特异性相互作用降解mRNA或抑制靶基因的翻译，还可在特定条件下上调靶基因的蛋白表达和mRNA水平。研究表明，在自身免疫性疾病的发生与发展过程中，microRNA发挥着不可忽视的作用[1]。
本研究采用实时荧光定量PCR法检测36例SLE患者和30例健康人群血浆的miRNA-181a相对表达量，并同时检测SLE患者血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和补体C3、C4及系统性红斑狼疮活动指数(SLEDAI)等，分析miRNA-181a水平与这些临床指标的关系，探讨miRNA-181a在SLE疾病中的临床价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2015年1～6月来我院门诊和住院就诊的SLE患者36例，SLE诊断均符合1997年美国风湿病学会修订的SLE诊断指南，排除患有其他全身性疾病的患者。其中男7例，女29例，年龄23～61岁，平均(37±9)岁。系统性红斑狼疮活动指数(SLEDAI)≥6(活动期)21例，SLEDAI<6(稳定期)15例；另外选取来我院健康体检正常的30例人群作为对照人群(正常对照组)，排除有高血压、心脏病、糖尿病、自身免疫性疾病及其他疾病者，不得具备SLE诊断标准中的任何一条。其中男5例，女25例，年龄21～57岁，平均年龄(36±7)岁，两组间年龄、性别等差异无统计学意义。患者进入研究后即对患者进行全面的检查并根据检查情况计算其SLEDAI评分[2]。血沉的检测采用魏氏法，C反应蛋白与免疫球蛋白IgG、、IgA、IgM和补体C3、C4的检测均在Beckman coulter Immage 800上进行。本研究得到了嘉兴市第二医院医学伦理委员会的批准，所有受试对象均知情同意。
1.2 仪器与试剂
实时荧光定量PCR仪Roche Cobas Z 480购自美国Roche公司，Eppendorf D30紫外分光光度计购自Eppendorf公司，PCR引物由上海生工合成，Trizol RNA提取试剂、BIOGHC Elitefast SYBR Kit及BIOG Super Reverse Transcriptase均购自Invitrogell公司。
1.3实验方法
1.3.1 标本处理 取SLE患者静脉血2 mL置于EDTA抗凝管中，800 g离心10 min后吸取上清血浆至1.5 mL EP管中，再次800 g离心10 min，取上清血浆-80℃冷冻保存，统一检测。正常对照组标本处理同前。
1.3.2 总RNA的提取与纯化 用 Trizol RNA提取试剂盒提取和纯化总RNA，按试剂说明书操作。应用Eppendor D30紫外分光光度仪检测总RNA 浓度和质量，检测合格者置-80℃冰箱冻存待用。
1.3.3 miRNA-181a的逆转录 应用BIOG Super Reverse Transcriptase对提取的总RNA中miRNA逆转录成cDNA。按说明书将总RNA 5 μL加入反应体系，miRNA-181a逆转录反应条件：25℃ 5 min，42℃ 15 min，85℃ 5 min；转录后得到的cDNA进行real-time PCR或-20℃保存备用。
1.3.4 Real-time PCR 在Cobas Z 480 PCR仪器上进行qRT-PCR。以小分子RNA U6作为内参，所用引物序列见表1。反应体系：cDNA 模板2 μL，2×BIOGHC Elitefast SYBR Master mix 10 μL，Primer Set 0.8 μL，加 RNase free ddH2O至20 μL。反應条件：95℃ 5 min一个循环，95℃ 10 sec，60℃ 30 sec共40个循环，溶解曲线一个循环。实验重复3次，计算各标本平均Ct值。miRNA-181a的相对含量以2-ΔΔCt表示[3]，ΔΔCt=实验组ΔCt(目的基因 Ct-内参基因 Ct)-对照组ΔCt(目的基因Ct-内参基因Ct)。 (李红胜 宁瑶 衡翔 李胜兵 陈松劲 叶俏)
[关键词] miRNA-181a；血浆；系统性红斑狼疮；临床指标；反转录PCR
[中图分类号] R593.241 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2016)32-0037-04
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种自身免疫介导的以免疫性炎症为突出表现、常累及多系统、多器官的自身免疫性疾病。SLE病因复杂，发病机制尚不明确，机体的免疫异常被认为是发病的关键原因。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类广泛存在于真核生物中、长度约21～25个核苷酸的非编码小分子RNA。它可通过与靶基因mRNA序列的特异性相互作用降解mRNA或抑制靶基因的翻译，还可在特定条件下上调靶基因的蛋白表达和mRNA水平。研究表明，在自身免疫性疾病的发生与发展过程中，microRNA发挥着不可忽视的作用[1]。
本研究采用实时荧光定量PCR法检测36例SLE患者和30例健康人群血浆的miRNA-181a相对表达量，并同时检测SLE患者血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM和补体C3、C4及系统性红斑狼疮活动指数(SLEDAI)等，分析miRNA-181a水平与这些临床指标的关系，探讨miRNA-181a在SLE疾病中的临床价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2015年1～6月来我院门诊和住院就诊的SLE患者36例，SLE诊断均符合1997年美国风湿病学会修订的SLE诊断指南，排除患有其他全身性疾病的患者。其中男7例，女29例，年龄23～61岁，平均(37±9)岁。系统性红斑狼疮活动指数(SLEDAI)≥6(活动期)21例，SLEDAI<6(稳定期)15例；另外选取来我院健康体检正常的30例人群作为对照人群(正常对照组)，排除有高血压、心脏病、糖尿病、自身免疫性疾病及其他疾病者，不得具备SLE诊断标准中的任何一条。其中男5例，女25例，年龄21～57岁，平均年龄(36±7)岁，两组间年龄、性别等差异无统计学意义。患者进入研究后即对患者进行全面的检查并根据检查情况计算其SLEDAI评分[2]。血沉的检测采用魏氏法，C反应蛋白与免疫球蛋白IgG、、IgA、IgM和补体C3、C4的检测均在Beckman coulter Immage 800上进行。本研究得到了嘉兴市第二医院医学伦理委员会的批准，所有受试对象均知情同意。
1.2 仪器与试剂
实时荧光定量PCR仪Roche Cobas Z 480购自美国Roche公司，Eppendorf D30紫外分光光度计购自Eppendorf公司，PCR引物由上海生工合成，Trizol RNA提取试剂、BIOGHC Elitefast SYBR Kit及BIOG Super Reverse Transcriptase均购自Invitrogell公司。
1.3实验方法
1.3.1 标本处理 取SLE患者静脉血2 mL置于EDTA抗凝管中，800 g离心10 min后吸取上清血浆至1.5 mL EP管中，再次800 g离心10 min，取上清血浆-80℃冷冻保存，统一检测。正常对照组标本处理同前。
1.3.2 总RNA的提取与纯化 用 Trizol RNA提取试剂盒提取和纯化总RNA，按试剂说明书操作。应用Eppendor D30紫外分光光度仪检测总RNA 浓度和质量，检测合格者置-80℃冰箱冻存待用。
1.3.3 miRNA-181a的逆转录 应用BIOG Super Reverse Transcriptase对提取的总RNA中miRNA逆转录成cDNA。按说明书将总RNA 5 μL加入反应体系，miRNA-181a逆转录反应条件：25℃ 5 min，42℃ 15 min，85℃ 5 min；转录后得到的cDNA进行real-time PCR或-20℃保存备用。
1.3.4 Real-time PCR 在Cobas Z 480 PCR仪器上进行qRT-PCR。以小分子RNA U6作为内参，所用引物序列见表1。反应体系：cDNA 模板2 μL，2×BIOGHC Elitefast SYBR Master mix 10 μL，Primer Set 0.8 μL，加 RNase free ddH2O至20 μL。反應条件：95℃ 5 min一个循环，95℃ 10 sec，60℃ 30 sec共40个循环，溶解曲线一个循环。实验重复3次，计算各标本平均Ct值。miRNA-181a的相对含量以2-ΔΔCt表示[3]，ΔΔCt=实验组ΔCt(目的基因 Ct-内参基因 Ct)-对照组ΔCt(目的基因Ct-内参基因Ct)。 (李红胜 宁瑶 衡翔 李胜兵 陈松劲 叶俏)