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编号:13069082
参附注射液对家兔心肺复苏后心肌细胞凋亡基因caspase—3的影响(2)
http://www.100md.com 2016年12月25日 中国现代医生2016年第36期
     将待检样品中加入浓度为0.25%胰蛋白酶进行消化,温度为37℃,将细胞收集后均匀吸出上层,反复操作5~6次。将混悬液进行离心处理,时间为10 min,转速为2000 r/min。采用DMEM洗涤后再次将混悬液进行离心处理,时间为10 min,转速同上。将上清液撇去后向其中加入浓度为20%的胎牛血清,并且在培养基中制作细胞悬液。在培养瓶中充入95%的空气以及5%的二氧化碳,将经过上述步骤处理的细胞孵育,时间为90 min。完成该项操作后将含有心肌细胞的培养液进行转移处理,在另一个培养瓶中继续进行培养,前72 h内需要向其中加入浓度为0.1 mmol/L的5-溴脱氧尿嘧啶,能够抑制非心肌细胞的增殖和分化。

    根据caspase-3试剂盒操作,计算得到各组caspase-3 mRNA的相对含量。方法为RT-PCR(实时PCR扩增试验),操作如下:首先提取总RNA,将抽提的总RNA按照模板进行合成。引物设计由深圳晶美生物工程有限公司完成并合成,然后配置20 μL PCR反应液,在95℃条件下热启动5 min,然后在95℃条件下水浴20 s ......
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