microRNA—149在顺铂耐药非小细胞肺癌细胞中的表达变化及相关机制研究(3)
1.7 双荧光素酶报告试验采用双荧光素酶报告试验验证miR-149与ABCC1的靶向关系。分别构建ABCC1 3’-UTR野生型及突变型荧光素酶报告质粒，分别命名为pMIR-ABCC1-wild与pMIR-ABCC1-mut。对A549细胞实施报告质粒与miR-149 mimic的共转染，转染组合为miR-149 mimic+pMIR-ABCC1-wild、mimic 阴性对照+pMIR-ABCC1-wild、miR-149 mimic+pMIR-ABCC1-mut以及mimic 阴性对照+pMIR-ABCC1-mut。将转染后的各组细胞以1×104/孔的密度种植于96孔板，继续培养48 h，随后每孔加入100 μL裂解液，收集裂解后的上清液，取出部分上清液加入40 μL萤火虫荧光素底物，混合均匀15 s 后测定荧光强度。剩余上清液加入40 μL海肾荧光素酶底物，混合均匀后测定荧光强度，计算萤火虫荧光素强度值与海肾荧光素强度值的比值。
1.8 凋亡分析
细胞经转染处理48 h后，以3×105/孔的密度种植于6孔板，待细胞贴壁后，加入15 μg/mL顺铂，处理48 h后收集细胞，70%预冷酒精固定12 h ......
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