金荞麦总黄酮提取工艺优化研究(1)
[摘要] 目的 优选金荞麦总黄酮的最佳提取工艺。 方法 采用乙醇回流提取金荞麦方法，以总黄酮含量为评价指标，选择乙醇浓度、溶媒倍数、提取时间和提取次数进行单因素考察，并通过 L9(34)正交试验设计优化金荞麦总黄酮的提取工艺。 结果 建立了金荞麦总黄酮的最佳提取工艺： 向金荞麦药材粉末中加入15 倍量65%的乙醇，80℃水浴回流提取3 次，每次提取2.0 h。 结论 优化的提取工艺稳定、合理、可行，能正确反映金荞麦总黄酮含量。
[关键词] 金荞麦;总黄酮;提取工艺;单因素;正交设计
[中图分类号] R284.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2018)34-0034-04
金荞麦[Fagopyrum cymosum(Trev.)Meisn]别名野荞麦、金锁银开、荞麦三七、苦荞头等，系双子叶蓼科荞麦属(Fagopyrum)植物，多见于海拔500～3000 m的阴湿山地、灌木丛、溪道旁等，资源非常丰富，为民间常用的清热解毒类中草药，临床应用也非常广泛[1，2]。现代临床上主要用于治疗阻塞性肺疾病[3，4]、肺脓肿[5]、支气管炎[6]、溃疡性结肠炎[7]、外感风热[8]等症。近年研究发现其具有较好的抗氧化[9，10]、降低血脂血糖[11，12]、抑制肿瘤[13]、抗菌[14]等作用，具有较高的研究价值。据相关文献报道，金荞麦的化学成分主要有黄酮类、甾体、有机酸类、萜类、苷类等，其中黄酮类成分是其主要的药理活性成分，主要包括芦丁、槲皮素木犀草素、表儿茶素、原矢车菊素等[15-17]。
金荞麦传统的入药部位是地下根，因加工的需求，其地上部分都被直接丢弃，造成严重浪费。本文首次选用金荞麦的全草作为研究对象，采用乙醇回流提取方法，通过单因素考察结合正交试验设计优化金荞麦总黄酮的提取工艺，以期能提高金荞麦资源的利用率，为金荞麦地上部分的开发利用提供实验依据。
1 材料与仪器
1.1 材料
金荞麦源自浙江省杭州市五云山，秋季10月采摘，为多年野生金荞麦植物，经浙江中医药大学俞冰教授鉴定，为2015版《中国药典》蓼科荞麦属药用金荞麦[Fagopyrum cymosum (Trev.)Meisn]植株;芦丁对照品(≥98%，批号：100080-200707)购自中国食品药品检定研究所;其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器
电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司];UV-2600a型紫外可见分光光度计[尤尼柯(上海)有限公司];HH-S 型电热恒温水浴锅(巩义市英峪予华仪器厂);SHB-Ⅲ型循环水式真空泵(巩义市英峪高科仪器厂);KQ5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);JP-500B打粉机(永康市久品工贸有限公司)。
2 方法与结果
2.1 对照品与供试品溶液的制备
2.1.1 对照品溶液制备 精密称取105 ℃烘干至恒重的芦丁对照品20 mg，置100 mL 量瓶中，加适量70%乙醇，超声溶解，放冷，加70 %乙醇至刻度，摇匀，即得(浓度为0. 2 mg/mL)。
2.1.2 供试品溶液制备 准确称取金荞麦粗粉(药材粉碎过60目筛)5.0 g，置250 mL圆底烧瓶中，加20倍量70%乙醇，80℃水浴回流提取2 次，每次1 h，趁热减压抽滤2 次，合并滤液至250 mL容量瓶中，加70%乙醇定容到刻度，備用。
2.2 金荞麦总黄酮的含量测定
2.2.1 线性关系考察 精密吸取芦丁对照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL，置于25 mL 量瓶中，再加1 mL 5% NaNO2 溶液，摇匀，放置6 min，加入1 mL 10%的Al(NO3)3 溶液，摇匀，放置6 min，再加入10 mL 4% NaOH溶液，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置15 min，随行试剂做空白，于510 nm 波长处测定吸光度，得吸光度Y与芦丁浓度X(μg/mL)的回归方程：Y=11.589X+0.0439，R2=0.9999。结果表明：芦丁在8～48 μg/mL范围内具有良好的线性关系。
2.2.2 精密度试验 精密吸取芦丁对照品溶液3.0 mL，按“2.2.1”项在510 nm 波长处连续测定6 次，计算吸光度值的RSD为1.34%，表明仪器的精密度良好。
2.2.3 稳定性试验 精密吸取供试液1.0 mL，按“2.2.1”项在510 nm波长处，分别在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min时间点测定吸光度，计算RSD值为0.30%，表明供试品溶液在30 min内稳定。
2.2.4 重复性试验 取同批次的金荞麦粗粉，按“2.1.2”项平行制备6 份供试品溶液，按“2.2.1”项测定吸光度。计算RSD为0.13%。表明该方法重复性良好。
2.2.5 加样回收试验 精密称取适量已知含量的金荞麦粗粉9 份，每份2.5 g，分别精密加入已知药材粗粉总黄酮含量80%、100%、120%的芦丁对照品。按“2.1.2”项制备供试品溶液，取供试品溶液1.0 mL 置25 mL 容量瓶中，其余操作同“2.2.1”，测定总黄酮含量，计算加样回收率。结果平均回收率为99.17%，RSD=2.23%。见表1。
2.2.6 含量测定 按2.1.2项方法制备供试品溶液，根据2.2.1项显色测定吸光度，按下式计算金荞麦总黄酮含量。, http://www.100md.com(赵炎军 蔡田恬 钱松 吴凡 黄蓓蓓)
[关键词] 金荞麦;总黄酮;提取工艺;单因素;正交设计
[中图分类号] R284.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2018)34-0034-04
金荞麦[Fagopyrum cymosum(Trev.)Meisn]别名野荞麦、金锁银开、荞麦三七、苦荞头等，系双子叶蓼科荞麦属(Fagopyrum)植物，多见于海拔500～3000 m的阴湿山地、灌木丛、溪道旁等，资源非常丰富，为民间常用的清热解毒类中草药，临床应用也非常广泛[1，2]。现代临床上主要用于治疗阻塞性肺疾病[3，4]、肺脓肿[5]、支气管炎[6]、溃疡性结肠炎[7]、外感风热[8]等症。近年研究发现其具有较好的抗氧化[9，10]、降低血脂血糖[11，12]、抑制肿瘤[13]、抗菌[14]等作用，具有较高的研究价值。据相关文献报道，金荞麦的化学成分主要有黄酮类、甾体、有机酸类、萜类、苷类等，其中黄酮类成分是其主要的药理活性成分，主要包括芦丁、槲皮素木犀草素、表儿茶素、原矢车菊素等[15-17]。
金荞麦传统的入药部位是地下根，因加工的需求，其地上部分都被直接丢弃，造成严重浪费。本文首次选用金荞麦的全草作为研究对象，采用乙醇回流提取方法，通过单因素考察结合正交试验设计优化金荞麦总黄酮的提取工艺，以期能提高金荞麦资源的利用率，为金荞麦地上部分的开发利用提供实验依据。
1 材料与仪器
1.1 材料
金荞麦源自浙江省杭州市五云山，秋季10月采摘，为多年野生金荞麦植物，经浙江中医药大学俞冰教授鉴定，为2015版《中国药典》蓼科荞麦属药用金荞麦[Fagopyrum cymosum (Trev.)Meisn]植株;芦丁对照品(≥98%，批号：100080-200707)购自中国食品药品检定研究所;其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器
电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司];UV-2600a型紫外可见分光光度计[尤尼柯(上海)有限公司];HH-S 型电热恒温水浴锅(巩义市英峪予华仪器厂);SHB-Ⅲ型循环水式真空泵(巩义市英峪高科仪器厂);KQ5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);JP-500B打粉机(永康市久品工贸有限公司)。
2 方法与结果
2.1 对照品与供试品溶液的制备
2.1.1 对照品溶液制备 精密称取105 ℃烘干至恒重的芦丁对照品20 mg，置100 mL 量瓶中，加适量70%乙醇，超声溶解，放冷，加70 %乙醇至刻度，摇匀，即得(浓度为0. 2 mg/mL)。
2.1.2 供试品溶液制备 准确称取金荞麦粗粉(药材粉碎过60目筛)5.0 g，置250 mL圆底烧瓶中，加20倍量70%乙醇，80℃水浴回流提取2 次，每次1 h，趁热减压抽滤2 次，合并滤液至250 mL容量瓶中，加70%乙醇定容到刻度，備用。
2.2 金荞麦总黄酮的含量测定
2.2.1 线性关系考察 精密吸取芦丁对照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL，置于25 mL 量瓶中，再加1 mL 5% NaNO2 溶液，摇匀，放置6 min，加入1 mL 10%的Al(NO3)3 溶液，摇匀，放置6 min，再加入10 mL 4% NaOH溶液，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置15 min，随行试剂做空白，于510 nm 波长处测定吸光度，得吸光度Y与芦丁浓度X(μg/mL)的回归方程：Y=11.589X+0.0439，R2=0.9999。结果表明：芦丁在8～48 μg/mL范围内具有良好的线性关系。
2.2.2 精密度试验 精密吸取芦丁对照品溶液3.0 mL，按“2.2.1”项在510 nm 波长处连续测定6 次，计算吸光度值的RSD为1.34%，表明仪器的精密度良好。
2.2.3 稳定性试验 精密吸取供试液1.0 mL，按“2.2.1”项在510 nm波长处，分别在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min时间点测定吸光度，计算RSD值为0.30%，表明供试品溶液在30 min内稳定。
2.2.4 重复性试验 取同批次的金荞麦粗粉，按“2.1.2”项平行制备6 份供试品溶液，按“2.2.1”项测定吸光度。计算RSD为0.13%。表明该方法重复性良好。
2.2.5 加样回收试验 精密称取适量已知含量的金荞麦粗粉9 份，每份2.5 g，分别精密加入已知药材粗粉总黄酮含量80%、100%、120%的芦丁对照品。按“2.1.2”项制备供试品溶液，取供试品溶液1.0 mL 置25 mL 容量瓶中，其余操作同“2.2.1”，测定总黄酮含量，计算加样回收率。结果平均回收率为99.17%，RSD=2.23%。见表1。
2.2.6 含量测定 按2.1.2项方法制备供试品溶液，根据2.2.1项显色测定吸光度，按下式计算金荞麦总黄酮含量。, http://www.100md.com(赵炎军 蔡田恬 钱松 吴凡 黄蓓蓓)