山豆根内生真菌的分离与鉴定(2)
1.2.2 山豆根药材的前处理 山豆根用自来水冲洗至水澄清,晾干后放置于超净工作台,进行表面消毒:先将山豆根在5%的次氯酸钠溶液中浸泡1 min,然后用灭菌过的超纯水(UP水)冲洗3遍,再置于75%的乙醇溶液中浸泡1 min,取出后同样用灭菌过的UP水冲洗3遍,最后用滤纸将山豆根表面的水分吸干[6]。1.2.3 分离与培养 剪刀、镊子高压灭菌,将山豆根块根用剪刀去皮,剪碎成小块,用镊子将剪碎山豆根块根平铺在配置好的孟加拉红培养基和PDA培养基表面,每个培养基上均匀放置3块,并初步固定,封口膜封好培养皿,放置于(28±1)℃恒温培养箱中培养孵化[7]。每隔24 h观察1次,待菌落形成,在培养皿上做好标记,将菌挑于单个PDA平板培养皿内,重复此步骤至不能再挑出形态不一样的菌落为止。根据菌落形态特征,采用平板梯度稀释法分离、纯化内生菌,最后,将已纯化的单一的菌株转入PDA斜面培养基,于(28±1)℃恒温培养7 d[8]。
1.3 DNA的提取
将菌株接于PDA培养基中于25℃摇床恒温培养72 h,收集新鲜的菌丝,用CTAB法对总DNA进行提取[9] ......
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