张远，郑恺忻，贺瑞,，王进涛，沈悦，钟良军,

    组织块法重复培养牙周膜干细胞的生物学功能研究

    张远1，郑恺忻2，贺瑞2,3，王进涛3，沈悦1，钟良军1,2

    1.杭州师范大学附属医院牙周病诊疗中心，浙江杭州 310015；2.杭州师范大学口腔医学院，浙江杭州 310015；3.杭州师范大学附属医院口腔医学中心，浙江杭州 310015

    对同一块牙周膜组织重复培养获得的原代牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell，PDLSC)的生物学特性和功能进行比较，评价重复培养得到的PDLSC能否用于实验研究和临床治疗。收集正畸治疗拔除的前磨牙，组织块法进行PDLSC原代培养。首次传代后收集剩余的牙周膜组织重复进行组织块法细胞培养，多次培养获得原代PDLSC。每次培养的原代PDLSC进行扩增培养，选取第1、3、5次培养获得的PDLSC分为A、B、C组。分别绘制细胞增殖曲线，STRO-1表面标记物表达的检测鉴定，细胞周期分布检测和观察成骨诱导，测定各组PDLSC端粒长度和端粒酶表达水平。三组细胞的STRO-1表达均呈阳性；生长趋势和扩增数量相似；A、B两组细胞周期分布无显著差异(>0.05)，C组与A、B组比较细胞周期分布差异显著(0.05)，C组PDLSC端粒长度显著长于A、B组(1 材料与方法

    1.1 一般资料

    选取因正畸治疗需要拔除的前磨牙20颗，牙齿获得均经患者本人及监护人同意，并签署知情同意书。患者无全身系统性疾病、家族遗传病和特殊服药史，临床检查牙齿无牙体及根尖周病变，无牙周病变。将初次培养获得的PDLSC和第3次、第5次重复培养获得的PDLSC分别设为A组、B组和C组。本研究经杭州师范大学附属医院伦理委员会审查通过[伦理审批号：2021(E2)-KS-100]。

    1.2 方法

    1.2.1 PDLSC重复培养和分离纯化 正畸减数牙拔出后立即用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)反复冲洗后转运至干细胞实验室，轻柔刮取根中1/3牙周膜组织，置入细胞培养瓶内，加入10%胎牛血清5ml，100μmol/L L-抗坏血酸，2mmol/L L-谷胺酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM培养基，37℃、5% CO2孵育箱培养，首次7d换液，首次换液前不做细胞观察，避免培养瓶晃动。当细胞生长达70%～80%融合时，消化并调整密度为10个/ml，接种于96孔板，每孔100μl ......