大肠杆菌O157检测方法概论及快速检测胶体金方法(2)
以上快速检测方法很少单独使用，更多情况下是多个方法复合使用，以提高检测准确性，缩短检测时间。但是这些方法还有许多方面需要改进，其各自的不足限制了检测方法的推广和运用；而且随着对大肠杆菌的检测速度和精确度要求的不断提高，需要建立更有效的方法，为人们的生活环境及安全提供有力的保障。
快速检测胶体金方法
这是一种简单快捷的肠出血性大肠杆菌检测方法，旨在制备出高灵敏度肠出血性大肠杆菌胶体金试纸条，直接检测样品中的肠出血性大肠杆菌，解决了长期存在的肠出血性大肠杆菌检测周期长，检测操作复杂的难题；此外，本发明采用的免疫胶体金层析分析法，纳米胶体金技术结合免疫原理，检测方法操作简单、方便快捷、准确灵敏，适合现场快速检测，利于检测部门的监控。
需要制备的材料：免疫抗原的制备：免疫小鼠：抗体的纯化：胶体金试纸条的制备。
免疫抗原的制备：将二代肠出血性大肠杆菌菌株制备成菌悬液。
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免疫小鼠：选用6～8周的BaIB/c小鼠，初次免疫菌悬液与弗氏完全佐剂混合，乳化完全，皮下多点注射，1m L/每只，每隔两周，用相同剂量的菌悬液与弗氏不完全佐剂进行加强免疫，共加强免疫两次，最后次免疫后8—10天小鼠尾部取血，通过间接ELISA测抗体血清效价，则进行小鼠眼部取血。
抗体的纯化：将血清置于Protein G亲和层析柱(KPL)吸附琼脂的表面，用10倍柱体积1×Washing/Binding Buffer洗吸附柱，用4倍柱体积的1×ElutionBuffer洗脱，得到肠出血性大肠杆菌特异性抗体。
1.胶体金试纸条制备的具体步骤
(1)胶体金的制备：利用冷凝回流装置将50mL质量分数为0.01%的氯金酸溶液加热至沸腾后迅速加入质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液1.2mL，待颜色稳定后继续煮沸10min，冷却，4℃保存备用，利用投射电镜和紫外光谱扫描仪分析胶体金的性状。
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(2)标记条件的选择：在酶标板孔中分别加入胶体金100μL，而后依次从少到多加入0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5μg的肠出血性大肠杆菌特异性抗体，混匀10min后备加入10%NaCl溶液20μL，于10min后肉眼观察反应结果。第一个保持不变颜色的孔的抗PBP2a单克隆抗体加入量即为最少稳定量，最少稳定量增加10%左右为实际标记量，取3支1.5mL离心管各装胶体金1mL，用0.1mol/L HCI和K2CO3分别调pH为7.2、8.2、9.2，加入最佳标记抗体量，对比标记效果。
(3)免疫胶体金制备：取10mL胶体金于三角瓶中，用K2CO3调pH为最佳标记条件，加入最佳标记抗体量，RT搅拌反应30min，得免疫胶体金，8000rpm离心30min，用1mL PBS复溶免疫胶体金备用，将制备好的免疫胶体金喷涂在玻璃纤维膜上制成胶体金垫。
(4)层析NC膜的制备：将羊抗鼠二抗(C线)和肠出血性大肠杆菌多克隆抗体(T线)分别划在NC膜上，制成层析NC膜。
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(5)纸条的组装：取一张PVC底板，在离上方18mm处贴上20mm宽的硝酸纤维膜，上方贴上19mm宽的吸水纸，压上硝酸纤维膜1mm，硝酸纤维膜下方贴上结合垫，结合垫压硝酸纤维膜1mm，胶体金垫下面贴上玻璃纤维膜，压上胶体金垫3mm，下端与底板对齐，见图1。
2.大肠杆菌O157快速检测试剂盒
(1)检测原理
本品采用鼠抗大肠杆菌特异性单克隆抗体和羊抗鼠IgG分别包被硝酸纤维素膜作为检测线和质控线，胶体金标记的兔抗大肠杆菌抗体及其他试剂组成。应用层析式双抗体夹心原理定性检测样本中的大肠杆菌O157。
(2)检测范围
肉类、豆制品、海产品，冷饮。
(3)技术指标
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检测下限：1×103CFU/mL。
(4)检测步骤
①样品处理：
加4mL无菌生理盐水于5mL装有增菌培养基的离心管中，振摇，使培养基充分溶解，无菌称取剪碎(剪刀灭菌)的样品(固态)0.5g(液态0.5mL)，加入增菌培养基中，37℃恒温恒湿4-6h，上清为样品检测液，待检。
②样品检测：
从原包装袋中取出检测卡，水平放置于观察者正面，做好编号标记(打开后请立即使用)。
用包装内所附无菌吸管吸取样品检测液，滴加3滴(约90μL)于加样孔中。加样后开始计时，结果应在5～10分钟内读取，其他时间判断结果仅供参考。
, 百拇医药 (5)结果判断
结果判断见图2。
阴性(-)：T线不显色，表示样品中不含大肠杆菌O157或大肠杆菌O157含量低于1×103CFU/mL：
阳性(+)：T线与C线同时出现，表示样品中大肠杆菌O157含量等于或高于1×103CFU/mL；
无效：C线未出现或两条线都不出现，表示前处理操作有误或检测卡已变质失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并重新试验。
(6)注意事项
在环境温度20～30℃下操作；检测卡极易受潮，打开小包装后应立即使用；
本产品在4-30℃密封干燥保存；忌冷冻：检测卡保存期1年：
操作的原则是不能污染待检样品，所有跟待检样品接触的器具都应灭菌，或一次性灭菌器具，操作人员应戴口罩，无菌手套。, http://www.100md.com(韩琰旭 陈发荣 崔德鹏)
快速检测胶体金方法
这是一种简单快捷的肠出血性大肠杆菌检测方法，旨在制备出高灵敏度肠出血性大肠杆菌胶体金试纸条，直接检测样品中的肠出血性大肠杆菌，解决了长期存在的肠出血性大肠杆菌检测周期长，检测操作复杂的难题；此外，本发明采用的免疫胶体金层析分析法，纳米胶体金技术结合免疫原理，检测方法操作简单、方便快捷、准确灵敏，适合现场快速检测，利于检测部门的监控。
需要制备的材料：免疫抗原的制备：免疫小鼠：抗体的纯化：胶体金试纸条的制备。
免疫抗原的制备：将二代肠出血性大肠杆菌菌株制备成菌悬液。
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免疫小鼠：选用6～8周的BaIB/c小鼠，初次免疫菌悬液与弗氏完全佐剂混合，乳化完全，皮下多点注射，1m L/每只，每隔两周，用相同剂量的菌悬液与弗氏不完全佐剂进行加强免疫，共加强免疫两次，最后次免疫后8—10天小鼠尾部取血，通过间接ELISA测抗体血清效价，则进行小鼠眼部取血。
抗体的纯化：将血清置于Protein G亲和层析柱(KPL)吸附琼脂的表面，用10倍柱体积1×Washing/Binding Buffer洗吸附柱，用4倍柱体积的1×ElutionBuffer洗脱，得到肠出血性大肠杆菌特异性抗体。
1.胶体金试纸条制备的具体步骤
(1)胶体金的制备：利用冷凝回流装置将50mL质量分数为0.01%的氯金酸溶液加热至沸腾后迅速加入质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液1.2mL，待颜色稳定后继续煮沸10min，冷却，4℃保存备用，利用投射电镜和紫外光谱扫描仪分析胶体金的性状。
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(2)标记条件的选择：在酶标板孔中分别加入胶体金100μL，而后依次从少到多加入0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5μg的肠出血性大肠杆菌特异性抗体，混匀10min后备加入10%NaCl溶液20μL，于10min后肉眼观察反应结果。第一个保持不变颜色的孔的抗PBP2a单克隆抗体加入量即为最少稳定量，最少稳定量增加10%左右为实际标记量，取3支1.5mL离心管各装胶体金1mL，用0.1mol/L HCI和K2CO3分别调pH为7.2、8.2、9.2，加入最佳标记抗体量，对比标记效果。
(3)免疫胶体金制备：取10mL胶体金于三角瓶中，用K2CO3调pH为最佳标记条件，加入最佳标记抗体量，RT搅拌反应30min，得免疫胶体金，8000rpm离心30min，用1mL PBS复溶免疫胶体金备用，将制备好的免疫胶体金喷涂在玻璃纤维膜上制成胶体金垫。
(4)层析NC膜的制备：将羊抗鼠二抗(C线)和肠出血性大肠杆菌多克隆抗体(T线)分别划在NC膜上，制成层析NC膜。
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(5)纸条的组装：取一张PVC底板，在离上方18mm处贴上20mm宽的硝酸纤维膜，上方贴上19mm宽的吸水纸，压上硝酸纤维膜1mm，硝酸纤维膜下方贴上结合垫，结合垫压硝酸纤维膜1mm，胶体金垫下面贴上玻璃纤维膜，压上胶体金垫3mm，下端与底板对齐，见图1。
2.大肠杆菌O157快速检测试剂盒
(1)检测原理
本品采用鼠抗大肠杆菌特异性单克隆抗体和羊抗鼠IgG分别包被硝酸纤维素膜作为检测线和质控线，胶体金标记的兔抗大肠杆菌抗体及其他试剂组成。应用层析式双抗体夹心原理定性检测样本中的大肠杆菌O157。
(2)检测范围
肉类、豆制品、海产品，冷饮。
(3)技术指标
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检测下限：1×103CFU/mL。
(4)检测步骤
①样品处理：
加4mL无菌生理盐水于5mL装有增菌培养基的离心管中，振摇，使培养基充分溶解，无菌称取剪碎(剪刀灭菌)的样品(固态)0.5g(液态0.5mL)，加入增菌培养基中，37℃恒温恒湿4-6h，上清为样品检测液，待检。
②样品检测：
从原包装袋中取出检测卡，水平放置于观察者正面，做好编号标记(打开后请立即使用)。
用包装内所附无菌吸管吸取样品检测液，滴加3滴(约90μL)于加样孔中。加样后开始计时，结果应在5～10分钟内读取，其他时间判断结果仅供参考。
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结果判断见图2。
阴性(-)：T线不显色，表示样品中不含大肠杆菌O157或大肠杆菌O157含量低于1×103CFU/mL：
阳性(+)：T线与C线同时出现，表示样品中大肠杆菌O157含量等于或高于1×103CFU/mL；
无效：C线未出现或两条线都不出现，表示前处理操作有误或检测卡已变质失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并重新试验。
(6)注意事项
在环境温度20～30℃下操作；检测卡极易受潮，打开小包装后应立即使用；
本产品在4-30℃密封干燥保存；忌冷冻：检测卡保存期1年：
操作的原则是不能污染待检样品，所有跟待检样品接触的器具都应灭菌，或一次性灭菌器具，操作人员应戴口罩，无菌手套。, http://www.100md.com(韩琰旭 陈发荣 崔德鹏)