大肠杆菌O157检测方法概论及快速检测胶体金方法(1)
大肠杆菌是一种革兰氏阴性短杆菌，它大量存在于人及其他恒温动物体内的肠道内，常随人及动物粪便块排出，会对水源造成污染。若在水和食品中检出，可认为是被粪便污染的指标。
目前，世界各国及国际组织都将大肠菌群数作为重要环境卫生学指标，并对其提出了严格的限制。中华人民共和国国家标准《生活饮用水水质卫生规范》规定，总大肠菌群及粪大肠菌群每100mL水样中不得检出。
O157型大肠杆菌是20世纪70年代后期发现的新型传染病，能引起人的出血性腹泻和肠炎，且并发溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等，严重的可致人死亡。
检测方法简介
检测大肠杆菌的传统方法包括多管发酵法和滤膜法。
1.多管发酵法
, 百拇医药 大肠杆菌多管发酵法是指多管发酵法大肠菌群阳性，在含有荧光底物的培养基上以44.5℃培养24h，能产生β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测水中大肠杆菌的方法。多管发酵法是对样品中活菌浓度的一种估计值。
多管发酵法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。比如水、乳制品及其他食品中大肠菌群的计数测定。在对一个产气肠杆菌纯培养物作计数时，应采用选择性平板计数法而不要采用多管发酵法。如果待检测的样品是以其他细菌为主的河水，就应选用多管发酵法。
2.滤膜法
滤膜法是指用孔径为0.45pm的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上，以37℃培养24h，形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测水中大肠菌群的方法。采用滤膜过滤器过滤水样，将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在品红硫酸钠培养基上进行培养，因大肠菌群可以发酵乳糖，在滤膜上出现紫红色具有金属光泽的菌落。直接计数滤膜上生长的典型大肠菌群菌落，可计算出每升水样中含有的大肠菌群数。如果有必要，对可疑菌落应进行涂片染色镜检，并再接种乳糖发酵管进一步鉴定。
, 百拇医药
滤膜法具有高度的再现性，可用于检验体积较大的水样，能比多管发酵技术更快地获得肯定的结果。不过在检验浑浊度高、非大肠杆菌类的细菌密度大的水样时，有其局限性。
目前，国内外研究人员已经应用了一些新方法进行大肠杆菌的快速检测，主要包括酶底物法、聚合酶链反应技术、免疫分析法、电化学方法、荧光法等。
3.酶底物法
在GBT5750.12-2006生活饮用水标准检验方法中介绍了大肠菌群和大肠杆菌酶底物法。大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生β-半乳糖昔酶(β-D-galactosidase)的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。大肠杆菌酶底物法是指在选择性培养基上能产生P-半乳糖昔酶(β-Dgalactosidase)分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，并能产生压葡萄糖醛酸酶(β-ghicuronidase)分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测大肠埃希氏菌的方法为大肠埃希氏菌酶底物法。
, 百拇医药
酶底物法之所以可以入选国家标准，是由于几乎所有的大肠菌群都有β-D-半乳糖普酶β-D-galactosidase)活性，94%～97%的大肠杆菌具有β-D-葡糖醛酸糖普酶(β-Dglucuronidase)活性，而且水体和食品中都缺少这两种酶。因此，基于这两种酶的水体和食品中大肠菌群及大肠杆菌的检测方法得到了迅速的发展。
4.聚合酶链反应技术
聚合酶链反应技术(PCR.Polymerase Chain Reaction)是利用从耐热菌中分离的DNA聚合酶，加入适量寡聚核普酸引物，以4种脱氧核普酸材料模拟天然DNA复制过程，在实验室条件下特异性扩增DNA(或RNA)片段的一种新技术。
PCR技术经过近20年的发展已经相当标准和成熟，与电化学传感器、酶联免疫分析及表面等离子共振传感器等检测方法结合，已被广泛应用于细菌的检测，成为微生物检测技术中常见而重要的最基础的分析手段之一。
, http://www.100md.com
PCR技术检测大肠杆菌有3点局限：一是难以精确定量；二是由于灵敏度高，操作不慎易交叉污染，产生假阳性，三是操作复杂，仪器昂贵，不利于大规模应用。
5.免疫分析法
免疫检测技术是基于抗体与抗原或半抗原之问的高选择性反应而建立起来的一种生物化学分析法，分为放射免疫分析、荧光免疫分析、化学发光免疫分析、酶免疫分析、酶联免疫分析及电化学免疫分析等非均相免疫分析和均相免疫分析。
免疫检测技术具有许多优点：第一，高选择性。抗体的特异性很高，在免疫分析中一般样品不需要预处理，这一点决定了分析结果的可靠性，同时可以省略预分离的过程。第二，高亲和性。保证分析数据的精密度和分析结果的准确性，这也是达到高灵敏分析的基础。事实上，抗体与抗原复合物的稳定常数一般为109，有些可达1014-1015，有较高的稳定性。第三，高灵敏性。抗体与其复合物间应有较大的信号反差，试剂空白低，从而结果准确而灵敏。免疫检测技术还具有检测时间短、样品通量大、检测成本低等优势。因此，在水体和食品中大肠杆菌的检测领域得到了诸多应用。
6.化学发光法
化学发光法是利用物质在进行化学反应过程中伴随的光辐射现象的一种化学分析方法。化学发光法在培养时间足够长的情况下可以检测到非常低的细菌浓度，最低可以准确检测到样品中的几个大肠杆菌。由于对细菌的渗透可以减胞内酶的扩散障碍，加速基底向酶的传递，科学工作者经常利用此来提高检测号。
除了上述的方法外，还有许多快速检测方法，如纳米装置、荧光分析结合免疫技术等方法，以及商业化的快速检测方法包括特异性检验的培养基、检测试纸片等。, 百拇医药(韩琰旭 陈发荣 崔德鹏)
目前，世界各国及国际组织都将大肠菌群数作为重要环境卫生学指标，并对其提出了严格的限制。中华人民共和国国家标准《生活饮用水水质卫生规范》规定，总大肠菌群及粪大肠菌群每100mL水样中不得检出。
O157型大肠杆菌是20世纪70年代后期发现的新型传染病，能引起人的出血性腹泻和肠炎，且并发溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等，严重的可致人死亡。
检测方法简介
检测大肠杆菌的传统方法包括多管发酵法和滤膜法。
1.多管发酵法
, 百拇医药 大肠杆菌多管发酵法是指多管发酵法大肠菌群阳性，在含有荧光底物的培养基上以44.5℃培养24h，能产生β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测水中大肠杆菌的方法。多管发酵法是对样品中活菌浓度的一种估计值。
多管发酵法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。比如水、乳制品及其他食品中大肠菌群的计数测定。在对一个产气肠杆菌纯培养物作计数时，应采用选择性平板计数法而不要采用多管发酵法。如果待检测的样品是以其他细菌为主的河水，就应选用多管发酵法。
2.滤膜法
滤膜法是指用孔径为0.45pm的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上，以37℃培养24h，形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测水中大肠菌群的方法。采用滤膜过滤器过滤水样，将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在品红硫酸钠培养基上进行培养，因大肠菌群可以发酵乳糖，在滤膜上出现紫红色具有金属光泽的菌落。直接计数滤膜上生长的典型大肠菌群菌落，可计算出每升水样中含有的大肠菌群数。如果有必要，对可疑菌落应进行涂片染色镜检，并再接种乳糖发酵管进一步鉴定。
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滤膜法具有高度的再现性，可用于检验体积较大的水样，能比多管发酵技术更快地获得肯定的结果。不过在检验浑浊度高、非大肠杆菌类的细菌密度大的水样时，有其局限性。
目前，国内外研究人员已经应用了一些新方法进行大肠杆菌的快速检测，主要包括酶底物法、聚合酶链反应技术、免疫分析法、电化学方法、荧光法等。
3.酶底物法
在GBT5750.12-2006生活饮用水标准检验方法中介绍了大肠菌群和大肠杆菌酶底物法。大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生β-半乳糖昔酶(β-D-galactosidase)的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。大肠杆菌酶底物法是指在选择性培养基上能产生P-半乳糖昔酶(β-Dgalactosidase)分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，并能产生压葡萄糖醛酸酶(β-ghicuronidase)分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测大肠埃希氏菌的方法为大肠埃希氏菌酶底物法。
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酶底物法之所以可以入选国家标准，是由于几乎所有的大肠菌群都有β-D-半乳糖普酶β-D-galactosidase)活性，94%～97%的大肠杆菌具有β-D-葡糖醛酸糖普酶(β-Dglucuronidase)活性，而且水体和食品中都缺少这两种酶。因此，基于这两种酶的水体和食品中大肠菌群及大肠杆菌的检测方法得到了迅速的发展。
4.聚合酶链反应技术
聚合酶链反应技术(PCR.Polymerase Chain Reaction)是利用从耐热菌中分离的DNA聚合酶，加入适量寡聚核普酸引物，以4种脱氧核普酸材料模拟天然DNA复制过程，在实验室条件下特异性扩增DNA(或RNA)片段的一种新技术。
PCR技术经过近20年的发展已经相当标准和成熟，与电化学传感器、酶联免疫分析及表面等离子共振传感器等检测方法结合，已被广泛应用于细菌的检测，成为微生物检测技术中常见而重要的最基础的分析手段之一。
, http://www.100md.com
PCR技术检测大肠杆菌有3点局限：一是难以精确定量；二是由于灵敏度高，操作不慎易交叉污染，产生假阳性，三是操作复杂，仪器昂贵，不利于大规模应用。
5.免疫分析法
免疫检测技术是基于抗体与抗原或半抗原之问的高选择性反应而建立起来的一种生物化学分析法，分为放射免疫分析、荧光免疫分析、化学发光免疫分析、酶免疫分析、酶联免疫分析及电化学免疫分析等非均相免疫分析和均相免疫分析。
免疫检测技术具有许多优点：第一，高选择性。抗体的特异性很高，在免疫分析中一般样品不需要预处理，这一点决定了分析结果的可靠性，同时可以省略预分离的过程。第二，高亲和性。保证分析数据的精密度和分析结果的准确性，这也是达到高灵敏分析的基础。事实上，抗体与抗原复合物的稳定常数一般为109，有些可达1014-1015，有较高的稳定性。第三，高灵敏性。抗体与其复合物间应有较大的信号反差，试剂空白低，从而结果准确而灵敏。免疫检测技术还具有检测时间短、样品通量大、检测成本低等优势。因此，在水体和食品中大肠杆菌的检测领域得到了诸多应用。
6.化学发光法
化学发光法是利用物质在进行化学反应过程中伴随的光辐射现象的一种化学分析方法。化学发光法在培养时间足够长的情况下可以检测到非常低的细菌浓度，最低可以准确检测到样品中的几个大肠杆菌。由于对细菌的渗透可以减胞内酶的扩散障碍，加速基底向酶的传递，科学工作者经常利用此来提高检测号。
除了上述的方法外，还有许多快速检测方法，如纳米装置、荧光分析结合免疫技术等方法，以及商业化的快速检测方法包括特异性检验的培养基、检测试纸片等。, 百拇医药(韩琰旭 陈发荣 崔德鹏)