门头沟区腹泻病例来源副溶血性弧菌和沙门氏菌主动监测、溯源和分子分型研究(1)
摘 要：依托北京市食源性疾病主动监测体系，开展了解北京市门头沟区食源性疾病腹泻病例来源的副溶血性弧菌、沙门氏菌分子特征和血清学分型。2014年4月～2015年3月，对北京门头沟区食源性疾病监测分离到的副溶血弧菌和沙门氏菌进行PFEG分子分型和图谱分析。11株副溶血弧菌经PFEG分型后，得到10个不同的带型，带型间相似度在0%～84.6%之间；21株沙门氏菌获得16种带型，带型间相似度在20.8%～88.9%之间菌株，部分菌株具有高度同源性，但总体遗传特证多样。门头沟区食源性疾病病例的部分副溶血弧菌和沙门氏菌的分子分型具有一定的相似度，菌株分子特征呈现遗传多样性，说明建立门头沟区食源性疾病病原菌分子分型图谱库，对于食物中毒快速检测、诊断及溯源具有重大意义。
关键词：食源性疾病 腹泻 副溶血弧菌 沙门氏菌 分子分型
食源性疾病作为全球主要的公共卫生问题之一，其危害程度和导致的损失呈现逐年递增的趋势，食品中侵染的致病生物因子是食源性疾病暴发的主要病原和诱因。我国食源性疾病的发生往往是由细菌性微生物引起，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhosa)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)和志贺氏菌(Shigella spp)是主要的3类食源性致病菌[1]。副溶血弧菌(Vi. parahemolyticus)作为一种嗜盐性弧菌，已成为我国最主要的食源性水产品致病菌[2]，也是近20年来我国食源性疾病暴发的最常见的病原菌[3]。同时，沙门氏菌病也是世界范围主要的的食源性疾病之一，主要是摄入沙门氏菌污染的肉、蛋、奶等动物源性食品而导致食源性疾病的暴发，患者多表现为腹泻、发热、腹痛或痉孪、呕吐、头痛和恶心等典型症状[4]。副溶血弧菌、沙门氏菌频繁导致食源性疾病的暴发，凸显了食源性疾病来源的副溶血弧菌、沙门氏菌的主动监测以及分子分型和溯源防控的重要性。
食源性致病菌分子溯源通过对病人中食源性致病菌分离株进行分子分型和比对分析，开展分布调查和追踪溯源，能够早期发现和识别聚集性病例和暴发线索，对于食源性致病菌监测，传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查以及防控措施制定实施有着非常重要的意义。本文针对门头沟区食源性疾病主动监测哨点医院诊断病例为监测对象，采集符合食源性疾病病例病人的大便样本，进行副溶血弧菌、沙门氏菌的监测和分子分型溯源，对于全面了解门头沟区副溶血弧菌、沙门氏菌的分子流行病学特点，及时识别聚集性病例和暴发线索，制定合理的控制预防措施，提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
1.1.1 监测点设置
选取北京市门头沟区医院、京煤集团总医院作为食源性疾病来源的副溶血弧菌、沙门氏菌的主动监测点，诊断医生根据病例定义筛选病人进行监测样本的采集，北京市门头沟疾控中心微生物检验科负责副溶血弧菌、沙门氏菌的检测、鉴定，分子分型由北京市疾控中心完成。
1.1.2 病例定义[5]
由食品或怀疑由食品引起的，以腹泻症状为主诉的就诊病例。腹泻是指每日排便3次或3次以上，且粪便性状异常，如稀便、水样便、粘液便或脓血便等。
1.1.3 样本采集
采集监测病例新鲜粪便1～2g置于无菌塑料便盒中(如采样困难，可采用无菌棉拭子以直肠内采集粪便后，置Cary-Blair运送培养基，室温保存运送，忌冰箱冷藏)，2～8℃、4h内检测。2014年4月～2015年3月，共完成350件样本的采集和监测。
1.1.4 主要设备与试剂
弧菌显色培养基、沙门氏菌显色培养基(郑州人福博赛生物技术有限公司)；3%氯化钠碱性蛋白胨水、3%氯化钠三糖铁琼脂、嗜盐性试验培养基(0%、3%、6%、8%，北京陆桥技术有限公司)；API 20E生化鉴定条、浊度仪(Densimat)，梅里埃公司；Seakem Gold琼脂糖，美国Cambrex BioScience Rockland；蛋白酶K，德国Merck；限制性内切酶XbaⅠ，北京六合通经贸有限公司；脉冲场凝胶电泳仪及配套设备、凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad；试验用去离子水系统。
1.2 方法
1.2.1 检测方法
参照文献[5]规定的要求，参照GB 4789规定的方法进行病例大便样本的副溶血弧菌、沙门氏菌的检测、鉴定。
1.2.2 PFGE分型及聚类分析
参照国际食源性致病菌分子分型监测网络PulseNet以及2014年食源性疾病监测工作手册中副溶血弧菌和沙门氏菌的PFGE分型的标准操程序进行[6]。副溶血弧菌主要步骤：胶块内染色体DNA的酶切使用内切酶NotⅠ酶切(标准菌株H9812使用XbaⅠ酶切)，在CHEE MAPPER脉冲场电泳仪(美国Bio-Rad公司)上电泳(温度14℃、起始转换时间为10s，终止转换时间为35.03s)18h。电泳结束后，1%的EB染色30min，脱色90min后，使用Gel Doc EQ拍摄图像。沙门氏菌的主要步骤：细菌悬液浓度用VITEK浊度仪调至4.0～4.2麦氏浊度；取400μL菌悬液加等量的胶制备胶块；使用XbaⅠ限制性内切酶(40U)，37℃酶切3h；缓冲液为0.5×TBE；电泳电压为6V/cm；电泳参数为2.2～63.8s，19h；胶块电泳后使用GelRed染色，纯水脱色，读取电泳图谱。用BioNumerics软件对电泳图像进行数据分析，构建聚类树状图。聚类图类型根据非加权配对算术平均法构建，条带位置差异容许度设为1.5%。
2 结果
2.1 菌株的基本情况
2014年4月～2015年3月，北京市门头沟区350例主动监测病例样本中，共检测出副溶血弧菌、沙门氏菌食源性致病菌32株，食源性致病菌阳性检出率为9.14%。其中，11例样本副溶血弧菌阳性检出，病例阳性副溶血弧菌检出率为3.14%，在TCBS上呈现典型菌落特征；沙门氏菌阳性检出21例，检出率为6%，生化鉴定符合沙门氏菌特征。说明门头沟区食源性致病菌中副溶血弧菌、沙门氏菌为主要致病菌。 (王志越 吕秋艳 褚添 宋景红 刘海涛 庄国良 曹殿起 付慧英)
关键词：食源性疾病 腹泻 副溶血弧菌 沙门氏菌 分子分型
食源性疾病作为全球主要的公共卫生问题之一，其危害程度和导致的损失呈现逐年递增的趋势，食品中侵染的致病生物因子是食源性疾病暴发的主要病原和诱因。我国食源性疾病的发生往往是由细菌性微生物引起，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhosa)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)和志贺氏菌(Shigella spp)是主要的3类食源性致病菌[1]。副溶血弧菌(Vi. parahemolyticus)作为一种嗜盐性弧菌，已成为我国最主要的食源性水产品致病菌[2]，也是近20年来我国食源性疾病暴发的最常见的病原菌[3]。同时，沙门氏菌病也是世界范围主要的的食源性疾病之一，主要是摄入沙门氏菌污染的肉、蛋、奶等动物源性食品而导致食源性疾病的暴发，患者多表现为腹泻、发热、腹痛或痉孪、呕吐、头痛和恶心等典型症状[4]。副溶血弧菌、沙门氏菌频繁导致食源性疾病的暴发，凸显了食源性疾病来源的副溶血弧菌、沙门氏菌的主动监测以及分子分型和溯源防控的重要性。
食源性致病菌分子溯源通过对病人中食源性致病菌分离株进行分子分型和比对分析，开展分布调查和追踪溯源，能够早期发现和识别聚集性病例和暴发线索，对于食源性致病菌监测，传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查以及防控措施制定实施有着非常重要的意义。本文针对门头沟区食源性疾病主动监测哨点医院诊断病例为监测对象，采集符合食源性疾病病例病人的大便样本，进行副溶血弧菌、沙门氏菌的监测和分子分型溯源，对于全面了解门头沟区副溶血弧菌、沙门氏菌的分子流行病学特点，及时识别聚集性病例和暴发线索，制定合理的控制预防措施，提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
1.1.1 监测点设置
选取北京市门头沟区医院、京煤集团总医院作为食源性疾病来源的副溶血弧菌、沙门氏菌的主动监测点，诊断医生根据病例定义筛选病人进行监测样本的采集，北京市门头沟疾控中心微生物检验科负责副溶血弧菌、沙门氏菌的检测、鉴定，分子分型由北京市疾控中心完成。
1.1.2 病例定义[5]
由食品或怀疑由食品引起的，以腹泻症状为主诉的就诊病例。腹泻是指每日排便3次或3次以上，且粪便性状异常，如稀便、水样便、粘液便或脓血便等。
1.1.3 样本采集
采集监测病例新鲜粪便1～2g置于无菌塑料便盒中(如采样困难，可采用无菌棉拭子以直肠内采集粪便后，置Cary-Blair运送培养基，室温保存运送，忌冰箱冷藏)，2～8℃、4h内检测。2014年4月～2015年3月，共完成350件样本的采集和监测。
1.1.4 主要设备与试剂
弧菌显色培养基、沙门氏菌显色培养基(郑州人福博赛生物技术有限公司)；3%氯化钠碱性蛋白胨水、3%氯化钠三糖铁琼脂、嗜盐性试验培养基(0%、3%、6%、8%，北京陆桥技术有限公司)；API 20E生化鉴定条、浊度仪(Densimat)，梅里埃公司；Seakem Gold琼脂糖，美国Cambrex BioScience Rockland；蛋白酶K，德国Merck；限制性内切酶XbaⅠ，北京六合通经贸有限公司；脉冲场凝胶电泳仪及配套设备、凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad；试验用去离子水系统。
1.2 方法
1.2.1 检测方法
参照文献[5]规定的要求，参照GB 4789规定的方法进行病例大便样本的副溶血弧菌、沙门氏菌的检测、鉴定。
1.2.2 PFGE分型及聚类分析
参照国际食源性致病菌分子分型监测网络PulseNet以及2014年食源性疾病监测工作手册中副溶血弧菌和沙门氏菌的PFGE分型的标准操程序进行[6]。副溶血弧菌主要步骤：胶块内染色体DNA的酶切使用内切酶NotⅠ酶切(标准菌株H9812使用XbaⅠ酶切)，在CHEE MAPPER脉冲场电泳仪(美国Bio-Rad公司)上电泳(温度14℃、起始转换时间为10s，终止转换时间为35.03s)18h。电泳结束后，1%的EB染色30min，脱色90min后，使用Gel Doc EQ拍摄图像。沙门氏菌的主要步骤：细菌悬液浓度用VITEK浊度仪调至4.0～4.2麦氏浊度；取400μL菌悬液加等量的胶制备胶块；使用XbaⅠ限制性内切酶(40U)，37℃酶切3h；缓冲液为0.5×TBE；电泳电压为6V/cm；电泳参数为2.2～63.8s，19h；胶块电泳后使用GelRed染色，纯水脱色，读取电泳图谱。用BioNumerics软件对电泳图像进行数据分析，构建聚类树状图。聚类图类型根据非加权配对算术平均法构建，条带位置差异容许度设为1.5%。
2 结果
2.1 菌株的基本情况
2014年4月～2015年3月，北京市门头沟区350例主动监测病例样本中，共检测出副溶血弧菌、沙门氏菌食源性致病菌32株，食源性致病菌阳性检出率为9.14%。其中，11例样本副溶血弧菌阳性检出，病例阳性副溶血弧菌检出率为3.14%，在TCBS上呈现典型菌落特征；沙门氏菌阳性检出21例，检出率为6%，生化鉴定符合沙门氏菌特征。说明门头沟区食源性致病菌中副溶血弧菌、沙门氏菌为主要致病菌。 (王志越 吕秋艳 褚添 宋景红 刘海涛 庄国良 曹殿起 付慧英)