盐酸克仑特罗快速定量检测试剂条研制(时间分辨微球法)
目前，一般检测盐酸克仑特罗的快速诊断试剂条采用的方法是胶体金检测法，该方法虽然能满足快速现场检测的要求，但是只能定性判断样品的阴、阳性，而时间分辨微球检测试剂条可以实现现场的快速定量检测。时间分辨荧光微粒是将镧系稀土元素Eu3+、Tb3+等填入高分子纳米微粒内制成。将其用于免疫分析中，则是将蛋白共价交联在纳米微球表面的化学基团上，通过免疫反应和待检物结合，通过测定荧光强度来推算待检物的浓度。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
阳性尿样、阴性尿样、时间分辨微球(长沙特优异)、酪蛋白、Tris、BSA、Borax等化学试剂(购自Sigma)。盐酸克仑特罗单克隆抗体、盐酸克仑特罗BSA偶联物(购自杭州隆基生物)。
1.2 仪器与设备
高速冷冻离心机(湘仪)、超声波细胞粉碎仪(宁波新芝)、旋转混合仪(宁波新芝)、时间分辨读卡仪(苏州和迈)。
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1.3 方法
1.3.1 盐酸克仑特罗的标记时间分辨微球
1.3.1.1 配置标记使用的缓冲液
Buffer A：50mM MES溶液(pH6.0);
Buffer B：0.23% Tris+0.25% casein(pH8.0);
Buffer C：0.76% Borax(pH9.0) ;
Buffer D：0.76% Borax+0.25% Casein。
1.3.1.2 微球標记抗体
①100μL直径200nm的时间分辨微球，原始浓度1%(W/V)，稀释到900μL Buffer A中;
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②15000rpm离心20min，去上清;
③加入1000μL Buffer A，使用移液枪吹打混匀;
④15000rpm离心20min，去上清;
⑤加入1000μL Buffer C，超声2min(功率30%，超声5s，间歇5s，温度设定10℃宁波新芝JY92-IIN，2号变幅杆);
⑥配置50mg/mL EDAC溶液(使用纯化水溶解)，配置50mg/mL NHS溶液(使用纯化水溶解)，以上溶液现配现用。
⑦在稀释、超声好的1000μL微球溶液(0.1%W/V)中加入10μL EDAC溶液以及20μL NHS溶液，震荡混匀(旋涡混匀器)5min后，再用旋转混匀仪旋转混匀25min(室温条件);
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⑧15000rpm离心20min，去上清;
⑨加入1000μL Buffer C，使用移液枪吹打混匀后超声2min(功率65%，超声5s，间歇5s，温度设定25℃);
⑩15000rpm离心20min，去上清;
加入700μL Buffer C，使用移液枪吹打混匀后超声2min(功率65%，超声5s，间歇5s，温度设定25℃);
使用Buffer C稀释需要标记的蛋白(抗体0.1mg、重组抗原0.2mg)，在旋转混匀仪旋转混匀2h(室温条件);
加入100μL Buffer D，旋涡震荡匀混2min，在旋转混匀仪旋转混匀30min(室温条件);
15000rpm离心15min，去上清;
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加入1000μL Buffer B使用移液枪吹打混匀，超声1min(功率30%，超声5s，间歇5s，温度设定25℃);
15000rpm离心15min，去上清;
加入1000μL Buffer B使用移液枪吹打混匀，超声1min(功率30%，超声5s，间歇5s，温度设定25℃);
超声完毕的微球保存在2～8℃冰箱中。
1.3.2 试纸的制作
将标记好的微球抗体使用Buffer B稀释100倍，分装于反应杯中(每个反应杯装量300μL)，并进行铝塑封膜。该组件作为检测抗体反应液体。将盐酸克仑特罗BSA偶联物划膜在硝酸纤维素膜(赛多利斯CN140)上，使用浓度为0.2mg/mL;质控线包被浓度为1.0mg/mL羊抗鼠多抗，两者的划膜喷量为1.0μL/mL。按照正常组装方式分别将PVC塑料底板、硝酸纤维素膜(25mm)、空气滤膜(17mm)黏贴组装。
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1.3.3 试纸条检测
将盐酸克仑特罗使用阴性尿样稀释，建立梯度浓度标准品，浓度值分别为0.25ppb、0.5ppb、1ppb、2ppb、4ppb、8ppb、16ppb、32ppb。
使用反应杯自带的10μL采样头分别吸取不同浓度值的标准质控品，插入到反应杯中颠倒混匀5次，并滴加3滴混合液到试纸条的加样孔中，每个浓度标准质控品重复10个测试，一个80个测试。计时5min后将试剂条放入时间分辨读卡仪中检测原始信号值。并记录相应结果，并进行曲线拟合。
2 结果与讨论
使用OriginPro 8拟合软件计算拟合曲线以及分析相关系数，计算模型使用：y=A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)^p)。
计算赋值如下：
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A1：229.43258;A2：0.04056;X0：0.02722;P：1.06004;
拟合曲线R2为0.99。
3 结语
实验结果证明时间分辨荧光的理化性质具有以下优点：
①由于Eu3+等被纳米微粒包裹，消除了在水溶液中荧光淬灭的危险(Eu3+在水中不稳定);
②由于每个纳米微粒里可以包裹上万个Eu3+，因而能放大免疫反应效果;
③应用在免疫分析中，操作更加简便：只需要共价交联时间分辨荧光微粒和抗原抗体，在免疫反应后无需加入解离增强液便可读数。
与胶体金等传统的快诊方法相比，时间分辨微球法具有以下优点：
①可准确定量;
②定量检测范围更宽，信噪比更高;
③分析的灵敏度高——时间分辨荧光免疫层析分析仪的检测器采用的是PMT光电倍增管，比起传统仪器用的硅光电池的灵敏度更高;
④精密度高——传统的试纸条由5部分构成，吸水垫+NC膜+结合垫+样品垫+滤血片;而时间分辨荧光免疫层析试纸条则是由3部分构成，吸水垫+NC膜+多功能滤膜，因而CV值更小，精密度更高。, 百拇医药(宋文 何鲁江)
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
阳性尿样、阴性尿样、时间分辨微球(长沙特优异)、酪蛋白、Tris、BSA、Borax等化学试剂(购自Sigma)。盐酸克仑特罗单克隆抗体、盐酸克仑特罗BSA偶联物(购自杭州隆基生物)。
1.2 仪器与设备
高速冷冻离心机(湘仪)、超声波细胞粉碎仪(宁波新芝)、旋转混合仪(宁波新芝)、时间分辨读卡仪(苏州和迈)。
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1.3 方法
1.3.1 盐酸克仑特罗的标记时间分辨微球
1.3.1.1 配置标记使用的缓冲液
Buffer A：50mM MES溶液(pH6.0);
Buffer B：0.23% Tris+0.25% casein(pH8.0);
Buffer C：0.76% Borax(pH9.0) ;
Buffer D：0.76% Borax+0.25% Casein。
1.3.1.2 微球標记抗体
①100μL直径200nm的时间分辨微球，原始浓度1%(W/V)，稀释到900μL Buffer A中;
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②15000rpm离心20min，去上清;
③加入1000μL Buffer A，使用移液枪吹打混匀;
④15000rpm离心20min，去上清;
⑤加入1000μL Buffer C，超声2min(功率30%，超声5s，间歇5s，温度设定10℃宁波新芝JY92-IIN，2号变幅杆);
⑥配置50mg/mL EDAC溶液(使用纯化水溶解)，配置50mg/mL NHS溶液(使用纯化水溶解)，以上溶液现配现用。
⑦在稀释、超声好的1000μL微球溶液(0.1%W/V)中加入10μL EDAC溶液以及20μL NHS溶液，震荡混匀(旋涡混匀器)5min后，再用旋转混匀仪旋转混匀25min(室温条件);
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⑧15000rpm离心20min，去上清;
⑨加入1000μL Buffer C，使用移液枪吹打混匀后超声2min(功率65%，超声5s，间歇5s，温度设定25℃);
⑩15000rpm离心20min，去上清;
加入700μL Buffer C，使用移液枪吹打混匀后超声2min(功率65%，超声5s，间歇5s，温度设定25℃);
使用Buffer C稀释需要标记的蛋白(抗体0.1mg、重组抗原0.2mg)，在旋转混匀仪旋转混匀2h(室温条件);
加入100μL Buffer D，旋涡震荡匀混2min，在旋转混匀仪旋转混匀30min(室温条件);
15000rpm离心15min，去上清;
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加入1000μL Buffer B使用移液枪吹打混匀，超声1min(功率30%，超声5s，间歇5s，温度设定25℃);
15000rpm离心15min，去上清;
加入1000μL Buffer B使用移液枪吹打混匀，超声1min(功率30%，超声5s，间歇5s，温度设定25℃);
超声完毕的微球保存在2～8℃冰箱中。
1.3.2 试纸的制作
将标记好的微球抗体使用Buffer B稀释100倍，分装于反应杯中(每个反应杯装量300μL)，并进行铝塑封膜。该组件作为检测抗体反应液体。将盐酸克仑特罗BSA偶联物划膜在硝酸纤维素膜(赛多利斯CN140)上，使用浓度为0.2mg/mL;质控线包被浓度为1.0mg/mL羊抗鼠多抗，两者的划膜喷量为1.0μL/mL。按照正常组装方式分别将PVC塑料底板、硝酸纤维素膜(25mm)、空气滤膜(17mm)黏贴组装。
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1.3.3 试纸条检测
将盐酸克仑特罗使用阴性尿样稀释，建立梯度浓度标准品，浓度值分别为0.25ppb、0.5ppb、1ppb、2ppb、4ppb、8ppb、16ppb、32ppb。
使用反应杯自带的10μL采样头分别吸取不同浓度值的标准质控品，插入到反应杯中颠倒混匀5次，并滴加3滴混合液到试纸条的加样孔中，每个浓度标准质控品重复10个测试，一个80个测试。计时5min后将试剂条放入时间分辨读卡仪中检测原始信号值。并记录相应结果，并进行曲线拟合。
2 结果与讨论
使用OriginPro 8拟合软件计算拟合曲线以及分析相关系数，计算模型使用：y=A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)^p)。
计算赋值如下：
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A1：229.43258;A2：0.04056;X0：0.02722;P：1.06004;
拟合曲线R2为0.99。
3 结语
实验结果证明时间分辨荧光的理化性质具有以下优点：
①由于Eu3+等被纳米微粒包裹，消除了在水溶液中荧光淬灭的危险(Eu3+在水中不稳定);
②由于每个纳米微粒里可以包裹上万个Eu3+，因而能放大免疫反应效果;
③应用在免疫分析中，操作更加简便：只需要共价交联时间分辨荧光微粒和抗原抗体，在免疫反应后无需加入解离增强液便可读数。
与胶体金等传统的快诊方法相比，时间分辨微球法具有以下优点：
①可准确定量;
②定量检测范围更宽，信噪比更高;
③分析的灵敏度高——时间分辨荧光免疫层析分析仪的检测器采用的是PMT光电倍增管，比起传统仪器用的硅光电池的灵敏度更高;
④精密度高——传统的试纸条由5部分构成，吸水垫+NC膜+结合垫+样品垫+滤血片;而时间分辨荧光免疫层析试纸条则是由3部分构成，吸水垫+NC膜+多功能滤膜，因而CV值更小，精密度更高。, 百拇医药(宋文 何鲁江)