HPLC法对比分析不同的蓝莓提取物
摘 要：采用高效液相色谱法对两个不同厂家的蓝莓提取物和新鲜蓝莓中花青素的含量和种类进行对比，结果显示，A蓝莓提取物的花色苷种类单一，以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为主，花青素含量40.96%；B蓝莓提取物的花色苷种类丰富，花青素含量43.15%；新鲜蓝莓花青素含量4.45mg/g。虽然两个样品均达到了产品规格(花青素含量≥25%)，但A蓝莓提取物的色谱图与新鲜蓝莓果的的色谱图不符，该方法能明显对比出不同厂家蓝莓提取物的差异。
关键词：蓝莓提取物 花青素差异
蓝莓因富含丰富的花青素，对保护视力、缓解眼睛疲劳等具有良好效果，被誉为“美瞳之果”。现代药理学研究表明，花青素具有抗氧化、抗肿瘤、防治心脑血管疾病、促进视力等作用[1]，在临床上广泛应用于治疗高血压性视网膜病变等疾病，是眼科药物的主要活性成分[2]。蓝莓提取物是一种略带酸味的深紫色粉末，其由新鲜或冷冻的蓝莓果经提取精制而成。目前，蓝莓提取物在欧洲作为药物使用，在美国和日本则作为保健食品使用。
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蓝莓果实中存在的花青素种类主要有5种——矢车菊素(Cy)、飞燕草素(Dp)、芍药素(Pn)、牵牛花素(Pt)和锦葵素(Mv)，他们以单糖苷形式(阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖)存在[3]，其中3-糖苷在自然界中最丰富，而高效液相色谱(HPLC)法测定花青素以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为对照品居多。
随着人们生活水平的提高和对视力保护意识的增强，蓝莓提取物日益受到消费者的关注和青睐，也引起了不少生产企业的聚焦。本研究采用高效液相色谱法，以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷作为对照品，对两个不同厂家的蓝莓提取物与蓝莓鲜果中花青素的含量和种类进行了对比研究，为选购蓝莓提取物提供了有力的质量依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜蓝莓：贵州麻江产地；蓝莓提取物：厂家提供(分别编号A、B)；矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品(≥99%)：成都曼思特生物科技有限公司；甲醇：国产色谱纯；甲酸、盐酸等为国产分析纯。
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1.2 仪器与设备
A g i l e n t 1 2 6 0型高效液相色谱仪：A g i l e n t公司；H H - 2型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；A B 2 0 4 - N型电子天平：M E T T L E R T O L E D O公司；3 2 0 p H计：M e t e r M E T T L E R T O L E D O公司；超声清洗器：南昌科昌达超声波设备厂；离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；超纯水仪：H e a l F o r c e D e v e l o p m e n t L t d。
1.3 供试品溶液的制备
1.3.1蓝莓供试品溶液制备
精确称取新鲜蓝莓6 . 1 9 2 4 g，研碎，加入5 0 m L 2 %的盐酸甲醇溶液(V/ V)，常温超声提取1 h，4 0 0 0 r/ m i n离心1 5 m i n后取上清液，加2 %的盐酸甲醇溶液(V/ V)定容至1 0 0 m L，用0 . 4 5μm滤膜过滤即得蓝莓样品。
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1.3.2蓝莓提取物供试品溶液制备
分别精确称取两种提取物样品各1 0 . 0 m g，加3 %的甲酸水溶液(V/ V)定容至1 0 m L，用0 . 4 5μm滤膜过滤，即得蓝莓提取物样品。
1.3.3标准品溶液的制备
取矢车菊素- 3 - O -葡萄糖苷标准品，精密称定，加2 %的盐酸甲醇溶液(V/ V)制成浓度为0 . 0 4 9 m g / m L标准品溶液，用0 . 4 5μm滤膜过滤，即得标准品样品。
1.4 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18 5μm 250×4.6mm；检测波长：525nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL，梯度条件见表1。
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2 结果与分析
2.1 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品测定结果(见图1)
2.2 蓝莓提取物样品A、B与蓝莓的测定结果(见图2、图3、图4)
由图2、图3、图4可知，样品A的花色苷种类单一，同图1标准品的图谱类似，矢车菊素的峰面积明显较大，使其他小峰面积均可忽略不计；样品B的花色苷种类相对丰富，其中含有矢车菊素的峰。天然蓝莓果的花青素图谱是由多个峰组成，矢车菊素只占其中一部分。
2.3蓝莓、样品A、样品B的花色苷种类及含量对比(见图5、表2)
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表2的结果表明，按总峰面积计算花青素含量，样品A的总峰面积主要来源于矢车菊素，含量40.96%虽已达到了所谓的规格(花青素≥25%)，但来源不真实。样品B的花青素含量结果则是多个峰面积的总和，同样达到了产品规格。蓝莓果的花青素含量0.445%，即4.45mg /g，符合一般蓝莓果花青素的含量范围[4-8]。
图5的结果表明，与天然、新鲜的蓝莓果相比较，样品A花色苷种类单一，以矢车菊素-3-O-葡萄糖为主，样品B与鲜蓝莓原料中花色苷种类较一致。因样品A花色苷种类只有矢车菊素一个大峰，不符合天然蓝莓提取物的特点，不建议购买使用。
3 结论
蓝莓提取物被广泛应用于食品、药品、化妆品和保健产品等领域，具有巨大的市场潜力。正因其产品附加值高，利润空间相当巨大，多家企业都在生产、销售蓝莓提取物，其安全性和真实性成为人们，以及相关企业关注的焦点之一。本研究为鉴别蓝莓提取物提供了研究思路和方法，采用高效液相色谱法测定更准确、高效，但其分析方法尚需进一步优化、完善。
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参考文献：
[1] 刘学铭，廖森泰，肖更生，等.花青素的吸收与代谢研究进展[J].中草药，2007，38(6)：953-956.
[2] 刘春民，王抗美，邹玲.花青素对近视青少年视疲劳症状及视力的影响[J].中国实用眼科杂志，2005，23(6)：607-609.
[3] Alejandro. Purification and identification of Capulinanthocyanins[J].FoodChemistry，1999，65：201-206.
[4]田密霞， 李亚东，胡文忠等.60种蓝莓花青素的含量及抗氧化性的比较研究[J].食品研究与开发，2014，35(21)：1-5.
[5]王兆雨，徐美玲，朱蓓薇.蓝莓花青素的提取工艺条件[J].大连轻工业学院学 报，2007，26(3)：196-198.
[6]李路寧，陈 威，赵立仪等.蓝莓花青素的酰化及其抗氧化性评价[J]食品工业科技.2016.35(6)：102-106.
[7]孙倩怡，鲁宝君，张晶.蓝莓花青素的研究进展[J]食品工业科技.2016.20(37)：381-390.
[8]严红光，张文华，丁之恩.兔眼蓝莓花青素稳定性研究[J]食品工业科技.2013.13(34)：119-123., http://www.100md.com(谢有发 马晓娟 熊艳霞 杨凌宇 吕毅斌)
关键词：蓝莓提取物 花青素差异
蓝莓因富含丰富的花青素，对保护视力、缓解眼睛疲劳等具有良好效果，被誉为“美瞳之果”。现代药理学研究表明，花青素具有抗氧化、抗肿瘤、防治心脑血管疾病、促进视力等作用[1]，在临床上广泛应用于治疗高血压性视网膜病变等疾病，是眼科药物的主要活性成分[2]。蓝莓提取物是一种略带酸味的深紫色粉末，其由新鲜或冷冻的蓝莓果经提取精制而成。目前，蓝莓提取物在欧洲作为药物使用，在美国和日本则作为保健食品使用。
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蓝莓果实中存在的花青素种类主要有5种——矢车菊素(Cy)、飞燕草素(Dp)、芍药素(Pn)、牵牛花素(Pt)和锦葵素(Mv)，他们以单糖苷形式(阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖)存在[3]，其中3-糖苷在自然界中最丰富，而高效液相色谱(HPLC)法测定花青素以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为对照品居多。
随着人们生活水平的提高和对视力保护意识的增强，蓝莓提取物日益受到消费者的关注和青睐，也引起了不少生产企业的聚焦。本研究采用高效液相色谱法，以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷作为对照品，对两个不同厂家的蓝莓提取物与蓝莓鲜果中花青素的含量和种类进行了对比研究，为选购蓝莓提取物提供了有力的质量依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜蓝莓：贵州麻江产地；蓝莓提取物：厂家提供(分别编号A、B)；矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品(≥99%)：成都曼思特生物科技有限公司；甲醇：国产色谱纯；甲酸、盐酸等为国产分析纯。
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1.2 仪器与设备
A g i l e n t 1 2 6 0型高效液相色谱仪：A g i l e n t公司；H H - 2型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；A B 2 0 4 - N型电子天平：M E T T L E R T O L E D O公司；3 2 0 p H计：M e t e r M E T T L E R T O L E D O公司；超声清洗器：南昌科昌达超声波设备厂；离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；超纯水仪：H e a l F o r c e D e v e l o p m e n t L t d。
1.3 供试品溶液的制备
1.3.1蓝莓供试品溶液制备
精确称取新鲜蓝莓6 . 1 9 2 4 g，研碎，加入5 0 m L 2 %的盐酸甲醇溶液(V/ V)，常温超声提取1 h，4 0 0 0 r/ m i n离心1 5 m i n后取上清液，加2 %的盐酸甲醇溶液(V/ V)定容至1 0 0 m L，用0 . 4 5μm滤膜过滤即得蓝莓样品。
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1.3.2蓝莓提取物供试品溶液制备
分别精确称取两种提取物样品各1 0 . 0 m g，加3 %的甲酸水溶液(V/ V)定容至1 0 m L，用0 . 4 5μm滤膜过滤，即得蓝莓提取物样品。
1.3.3标准品溶液的制备
取矢车菊素- 3 - O -葡萄糖苷标准品，精密称定，加2 %的盐酸甲醇溶液(V/ V)制成浓度为0 . 0 4 9 m g / m L标准品溶液，用0 . 4 5μm滤膜过滤，即得标准品样品。
1.4 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18 5μm 250×4.6mm；检测波长：525nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL，梯度条件见表1。
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2 结果与分析
2.1 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品测定结果(见图1)
2.2 蓝莓提取物样品A、B与蓝莓的测定结果(见图2、图3、图4)
由图2、图3、图4可知，样品A的花色苷种类单一，同图1标准品的图谱类似，矢车菊素的峰面积明显较大，使其他小峰面积均可忽略不计；样品B的花色苷种类相对丰富，其中含有矢车菊素的峰。天然蓝莓果的花青素图谱是由多个峰组成，矢车菊素只占其中一部分。
2.3蓝莓、样品A、样品B的花色苷种类及含量对比(见图5、表2)
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表2的结果表明，按总峰面积计算花青素含量，样品A的总峰面积主要来源于矢车菊素，含量40.96%虽已达到了所谓的规格(花青素≥25%)，但来源不真实。样品B的花青素含量结果则是多个峰面积的总和，同样达到了产品规格。蓝莓果的花青素含量0.445%，即4.45mg /g，符合一般蓝莓果花青素的含量范围[4-8]。
图5的结果表明，与天然、新鲜的蓝莓果相比较，样品A花色苷种类单一，以矢车菊素-3-O-葡萄糖为主，样品B与鲜蓝莓原料中花色苷种类较一致。因样品A花色苷种类只有矢车菊素一个大峰，不符合天然蓝莓提取物的特点，不建议购买使用。
3 结论
蓝莓提取物被广泛应用于食品、药品、化妆品和保健产品等领域，具有巨大的市场潜力。正因其产品附加值高，利润空间相当巨大，多家企业都在生产、销售蓝莓提取物，其安全性和真实性成为人们，以及相关企业关注的焦点之一。本研究为鉴别蓝莓提取物提供了研究思路和方法，采用高效液相色谱法测定更准确、高效，但其分析方法尚需进一步优化、完善。
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参考文献：
[1] 刘学铭，廖森泰，肖更生，等.花青素的吸收与代谢研究进展[J].中草药，2007，38(6)：953-956.
[2] 刘春民，王抗美，邹玲.花青素对近视青少年视疲劳症状及视力的影响[J].中国实用眼科杂志，2005，23(6)：607-609.
[3] Alejandro. Purification and identification of Capulinanthocyanins[J].FoodChemistry，1999，65：201-206.
[4]田密霞， 李亚东，胡文忠等.60种蓝莓花青素的含量及抗氧化性的比较研究[J].食品研究与开发，2014，35(21)：1-5.
[5]王兆雨，徐美玲，朱蓓薇.蓝莓花青素的提取工艺条件[J].大连轻工业学院学 报，2007，26(3)：196-198.
[6]李路寧，陈 威，赵立仪等.蓝莓花青素的酰化及其抗氧化性评价[J]食品工业科技.2016.35(6)：102-106.
[7]孙倩怡，鲁宝君，张晶.蓝莓花青素的研究进展[J]食品工业科技.2016.20(37)：381-390.
[8]严红光，张文华，丁之恩.兔眼蓝莓花青素稳定性研究[J]食品工业科技.2013.13(34)：119-123., http://www.100md.com(谢有发 马晓娟 熊艳霞 杨凌宇 吕毅斌)