乳品中兽药残留荧光检测技术的应用进展(2)
3.2 时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析采用镧系稀土元素，如铕(Eu3+)螯合物标记抗原或抗体，螯合物经激发后可发射特征荧光，通过时间延迟和波长分辨进行检测，使强特异性荧光和背景干扰荧光区分开，有效地排除了干扰因素，提高了分析方法的灵敏度。
Leivo等应用TRF结合荧光免疫法对牛奶中的氟喹诺酮进行检测，其线性范围为0.2～68.0μg/L，并指出这种检测方法可以进一步优化以实现各种牛奶样品中氟喹诺酮的检测。高文慧等构建了Eu3+-苯甲酸(BA)-邻菲啰啉(Phen)三元配合物体系荧光探针，检测牛奶中盐酸四环素残留，其线性范围为1.0×10-6～5.0×10-5mol/L，且具有较好的选择性和较高的回收率。Bacigalupo等通过建立间接竞争TRFIA对牛奶中的氨苄青霉素进行定量分析，灵敏度明显高于ELISA，远超欧盟标准。
3.3 量子点荧光免疫分析
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以量子点作为荧光标记探针开发的荧光免疫分析方法，可利用其高强度的荧光信号，大幅度提高兽药残留的检测灵敏度。量子点荧光分析法具有快速、准确、灵敏以及优越的重现性，目前应用和研究愈发广泛。
李研东等通过制备量子点标记抗体，建立了四环素类药物残留量子点荧光免疫分析方法。结果显示，50%抑制浓度(IC50)为0.9μg/L;四环素、金霉素、土霉素的交叉反应率分别为100.0%、154.0%和46.4%;四环素、金霉素、土霉素的最低检出限分别为3.0μg/kg、2.0μg/kg和6.0μg/kg，样本添加回收率在78.7%～97.0%，批内、批间变异系数<15%。国家兽药安全评价中心于2007年建立了牛奶和猪肉中磺胺二甲嘧啶的直接竞争荧光免疫分析法，其中牛奶50%的抑制率(IC50)为4.3ng/mL，检测限为0.6ng/mL，此方法的回收率在94.0%～106.2%。Li等通过多残留荧光微球免疫层分析法对生乳中的红霉素、螺旋霉素、替米考星和泰乐菌素同时进行检测，结果显示，半抑制浓度(IC50)值分别为1.36ng/mL、1.22ng/mL、1.01ng/mL和1.39ng/mL，检测限(LOD)为0.13ng/mL，回收率范围分别为91.8%～109.2%、89.6%～114.4%、84.8%～111.6%和85.8%～115.2%。该方法大大简化了操作步骤，整个测试过程在20min内完成，节省了大量时间。
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3.4 上转换纳米粒子荧光免疫分析
HU等人将NaYF4：Yb/Tm上轉换纳米粒子标记抗体结合物作为荧光探针，单分散磁性聚苯乙烯微球标记抗原结合物作为免疫信号捕获探针，用于检测牛奶样本中的SQX。标准缓冲液SQX的LOD为0.1μg/L，样本中为0.5μg/L，标曲线性范围为0.1～100μg/L。样本中添加回收率为69.8%～133%，变异率为0.24%～25.06%。该方法无需前处理，可直接稀释测定，便于现场大批量检测。
王瑜等以上转换纳米粒子结合己烯雌酚单克隆抗体作为荧光探针，建立了上转换免疫层析荧光快速定量检测己烯雌酚残留方法。该试纸条线性范围为25～1000ng/mL，检出限为20.84ng/mL，批内、批间变异系数小于10%，牛奶样品的添加回收率为90.1%～115.2%，相对标准偏差小于5%，为牛奶中己烯雌酚残留快速定量检测提供了新的测定方法。
刘晓等以上转换发光材料为标记物，建立了可对奶制品中黄曲霉毒素M1进行现场快速检测的上转换荧光免疫层析方法。该方法对奶粉和牛奶中黄曲霉毒素M1的检测灵敏度分别达到0.1ng/mL和0.3ng/mL，每个浓度重复测量的变异系数小于15%。
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3.5 荧光猝灭免疫分析
荧光淬灭免疫分析法是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度降低的物理或化学作用的过程，与荧光物质分子相互作用引起荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂。胡高爽等依据荧光共振能量转移的原理，建立了一种新型免疫标记荧光猝灭试纸条检测牛奶中兽药磺胺喹恶啉(sulfaquinoxaline，SQX)的残留。该免疫荧光猝灭试纸条检测SQX的方法检测限为1μg/L，牛奶样品的检测限为8μg/L，且该方法操作简便、灵敏度高、检测时间短、结果易于判断，可以用于牛奶中SQX残留的现场快速检测。
3.6 荧光免疫层析分析
荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术，其以固定有检测线和质控线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。该方法具有灵敏度高、稳定性好、受自然荧光本底干扰低等优点，是快速检测分析研究的热点。
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Taranova等将具有不同发射波长的量子点偶联氯霉素抗体、链霉素抗体、氧氟沙星抗体为荧光探针，构建了可同时检测牛奶中3种抗生素的荧光免疫层析试纸条，该试纸条对氧氟沙星的检测限为0.3ng/mL，氯霉素的检测限为0.12ng/mL，链霉素的检测限为0.2ng/mL，比使用同一对应抗体建立ELISA方法的检测限低80～200倍，对实际牛奶样品的添加回收率为92%～101%。
4 展望
随着科学技术的日益提高，兽药残留检测技术的水平也在逐步提升。在乳品兽药残留的检测分析中，目前较为常用的仪器分析法、免疫分析法的灵敏度有了显著提高。相较于仪器分析和常用免疫分析的检测方法，荧光免疫分析技术由于灵敏度高、特异性强、体积小、操作简单、成本低等诸多优势受到科研工作者的广泛关注，但是也存在一些问题，需要科研工作者逐步进行完善。如开发、探索化学性能好，发光性能优良，在进一步提高检测结果准确度和灵敏度方面有极大潜能的新型标记物用于抗原抗体的标记等问题。
相信随着荧光免疫分析技术的不断完善，以及自身优势的凸显，其在乳品兽药残留检测领域中将得到更广泛的应用。, 百拇医药(方芳 郑君杰 孙志伟 李蓉蓉 刘薇 杨柳)
时间分辨荧光免疫分析采用镧系稀土元素，如铕(Eu3+)螯合物标记抗原或抗体，螯合物经激发后可发射特征荧光，通过时间延迟和波长分辨进行检测，使强特异性荧光和背景干扰荧光区分开，有效地排除了干扰因素，提高了分析方法的灵敏度。
Leivo等应用TRF结合荧光免疫法对牛奶中的氟喹诺酮进行检测，其线性范围为0.2～68.0μg/L，并指出这种检测方法可以进一步优化以实现各种牛奶样品中氟喹诺酮的检测。高文慧等构建了Eu3+-苯甲酸(BA)-邻菲啰啉(Phen)三元配合物体系荧光探针，检测牛奶中盐酸四环素残留，其线性范围为1.0×10-6～5.0×10-5mol/L，且具有较好的选择性和较高的回收率。Bacigalupo等通过建立间接竞争TRFIA对牛奶中的氨苄青霉素进行定量分析，灵敏度明显高于ELISA，远超欧盟标准。
3.3 量子点荧光免疫分析
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以量子点作为荧光标记探针开发的荧光免疫分析方法，可利用其高强度的荧光信号，大幅度提高兽药残留的检测灵敏度。量子点荧光分析法具有快速、准确、灵敏以及优越的重现性，目前应用和研究愈发广泛。
李研东等通过制备量子点标记抗体，建立了四环素类药物残留量子点荧光免疫分析方法。结果显示，50%抑制浓度(IC50)为0.9μg/L;四环素、金霉素、土霉素的交叉反应率分别为100.0%、154.0%和46.4%;四环素、金霉素、土霉素的最低检出限分别为3.0μg/kg、2.0μg/kg和6.0μg/kg，样本添加回收率在78.7%～97.0%，批内、批间变异系数<15%。国家兽药安全评价中心于2007年建立了牛奶和猪肉中磺胺二甲嘧啶的直接竞争荧光免疫分析法，其中牛奶50%的抑制率(IC50)为4.3ng/mL，检测限为0.6ng/mL，此方法的回收率在94.0%～106.2%。Li等通过多残留荧光微球免疫层分析法对生乳中的红霉素、螺旋霉素、替米考星和泰乐菌素同时进行检测，结果显示，半抑制浓度(IC50)值分别为1.36ng/mL、1.22ng/mL、1.01ng/mL和1.39ng/mL，检测限(LOD)为0.13ng/mL，回收率范围分别为91.8%～109.2%、89.6%～114.4%、84.8%～111.6%和85.8%～115.2%。该方法大大简化了操作步骤，整个测试过程在20min内完成，节省了大量时间。
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3.4 上转换纳米粒子荧光免疫分析
HU等人将NaYF4：Yb/Tm上轉换纳米粒子标记抗体结合物作为荧光探针，单分散磁性聚苯乙烯微球标记抗原结合物作为免疫信号捕获探针，用于检测牛奶样本中的SQX。标准缓冲液SQX的LOD为0.1μg/L，样本中为0.5μg/L，标曲线性范围为0.1～100μg/L。样本中添加回收率为69.8%～133%，变异率为0.24%～25.06%。该方法无需前处理，可直接稀释测定，便于现场大批量检测。
王瑜等以上转换纳米粒子结合己烯雌酚单克隆抗体作为荧光探针，建立了上转换免疫层析荧光快速定量检测己烯雌酚残留方法。该试纸条线性范围为25～1000ng/mL，检出限为20.84ng/mL，批内、批间变异系数小于10%，牛奶样品的添加回收率为90.1%～115.2%，相对标准偏差小于5%，为牛奶中己烯雌酚残留快速定量检测提供了新的测定方法。
刘晓等以上转换发光材料为标记物，建立了可对奶制品中黄曲霉毒素M1进行现场快速检测的上转换荧光免疫层析方法。该方法对奶粉和牛奶中黄曲霉毒素M1的检测灵敏度分别达到0.1ng/mL和0.3ng/mL，每个浓度重复测量的变异系数小于15%。
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3.5 荧光猝灭免疫分析
荧光淬灭免疫分析法是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度降低的物理或化学作用的过程，与荧光物质分子相互作用引起荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂。胡高爽等依据荧光共振能量转移的原理，建立了一种新型免疫标记荧光猝灭试纸条检测牛奶中兽药磺胺喹恶啉(sulfaquinoxaline，SQX)的残留。该免疫荧光猝灭试纸条检测SQX的方法检测限为1μg/L，牛奶样品的检测限为8μg/L，且该方法操作简便、灵敏度高、检测时间短、结果易于判断，可以用于牛奶中SQX残留的现场快速检测。
3.6 荧光免疫层析分析
荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术，其以固定有检测线和质控线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。该方法具有灵敏度高、稳定性好、受自然荧光本底干扰低等优点，是快速检测分析研究的热点。
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Taranova等将具有不同发射波长的量子点偶联氯霉素抗体、链霉素抗体、氧氟沙星抗体为荧光探针，构建了可同时检测牛奶中3种抗生素的荧光免疫层析试纸条，该试纸条对氧氟沙星的检测限为0.3ng/mL，氯霉素的检测限为0.12ng/mL，链霉素的检测限为0.2ng/mL，比使用同一对应抗体建立ELISA方法的检测限低80～200倍，对实际牛奶样品的添加回收率为92%～101%。
4 展望
随着科学技术的日益提高，兽药残留检测技术的水平也在逐步提升。在乳品兽药残留的检测分析中，目前较为常用的仪器分析法、免疫分析法的灵敏度有了显著提高。相较于仪器分析和常用免疫分析的检测方法，荧光免疫分析技术由于灵敏度高、特异性强、体积小、操作简单、成本低等诸多优势受到科研工作者的广泛关注，但是也存在一些问题，需要科研工作者逐步进行完善。如开发、探索化学性能好，发光性能优良，在进一步提高检测结果准确度和灵敏度方面有极大潜能的新型标记物用于抗原抗体的标记等问题。
相信随着荧光免疫分析技术的不断完善，以及自身优势的凸显，其在乳品兽药残留检测领域中将得到更广泛的应用。, 百拇医药(方芳 郑君杰 孙志伟 李蓉蓉 刘薇 杨柳)