四环素类药物时间分辨荧光层析检测试纸条的研制(2)
将试纸卡与微孔试剂组装成四环素类药物时间分辨荧光免疫层析试纸条，在2～8℃下阴凉避光干燥保存，有效期为12个月。
1.3.3 样品前处理
准确称取1g±0.01g组织样品至10mL离心管中，加入3mL样本提取液，涡动2min充分混匀后，3000r/min离心5min后取上清(若上层有漂浮物则拨开取上清)待检。
1.3.4 检测过程
用微量移液器准确吸取100μL待检样品溶液于微孔中，小心抽吸至充分与微孔中试剂混匀，室温(20～25℃)作用3min;吸取孔内混合液全部量(约100μL)垂直滴加于试纸卡加样孔(S孔)中，液体流动时开始计时，室温反应5min;用时间分辨荧光免疫分析仪或紫外光下肉眼判读结果。
1.3.5 检测结果分析
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阴性(-)：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阴性，或紫外灯下肉眼观察T线亮度比C线亮度亮一半以上，则表示样本中不含有四环素类药物或其浓度低于检测限。
阳性(+)：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阳性，或紫外灯下肉眼观察T线亮度比C线亮度暗一半以上，则表示样本中四环素类药物浓度等于或高于检测限。
无效：若质控区未检出荧光信号强度，表明操作过程不正确或试纸卡已失效。
2 结果与分析
2.1 精密度试验
向猪肉组织中分别加入1/2、1、2倍检测限浓度的四环素类药物，以未加入四环素类药物的猪肉组织为空白对照，每组检测10次。
同一添加浓度下，平行检测样的检测结果相同，同时检测线亮度保持一致。通过荧光检测仪对T、C线的亮度进行读数，计算试纸条的变异系数小于6%，说明本试验研发的四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析快速检测试纸条检测性能稳定，精密度高。
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2.2 检测限试验
向空白猪肉、鸡肉样品中分别添加四环素类药物标准品至终浓度为：四环素15、30、45、60μg/kg，金霉素30、60、90、120μg/kg，土霉素20、40、60、80μg/kg，强力霉素40、80、120、160μg/kg，分别以未添加四环素类药物的猪肉、鸡肉组织为空白对照，用时间分辨荧光免疫层析试纸条进行检测验证。
随着四环素类药物浓度的增加，试纸条检测结果阴性越明显。当猪肉组织和鸡肉组织中四环素类药物的添加量为1倍，即四环素为30μg/kg、金霉素为60μg/kg、土霉素为40μg/kg、强力霉素为80μg/kg时，T线亮度为C线亮度的一半左右，结合读数仪的检测结果可以进一步印证，本试验研发的四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析快速检测试纸条对四环素、金霉素、土霉素和强力霉素的检测限分别为30μg/kg、60μg/kg、40μg/kg、80μg/kg。
, http://www.100md.com 2.3 特异性试验
分别向猪肉组织中添加30μg/kg四环素(TC)、100μg/kg磺胺二甲基嘧啶(SM2)、恩诺沙星(ENR)、氯霉素(CAP)，以未添加任何药物的猪肉组织为空白对照，每个样品做2次平行试验。
当向检测样中添加30μg/kg四环素时，试纸条检测结果为阳性，而添加100μg/kg磺胺二甲基嘧啶、恩诺沙星、氯霉素等药物的检测样品检测结果均为阴性，即本试纸条对磺胺二甲基嘧啶、恩诺沙星、氯霉素等药物无交叉反应，特异性好。
2.4 稳定性试验
将试纸条分别置于4℃和37℃下14d与28d，相同情况下检测加入30μg/kg四环素的猪肉组织和鸡肉组织样品中，以未经过处理的试纸条检测值为空白对照，每个样品做3次平行试验，分别采用肉眼判断和读数仪对检测结果进行测定，用于检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条稳定性，结果如表1所示。
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从表1可以看出，本试验研发的四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析快速检测试纸条经高、低温处理后对四环素类药物的检测灵敏度没有发生显著变化，表明試纸条稳定性较强。
2.5 与其他检测方法的对比
分别用勤邦公司的四环素类药物检测胶体金试纸条、时间分辨荧光试纸条和仪器方法测定添加不同浓度四环素类药物的猪肉组织，仪器方法参考GB/T 21317-2007 《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》(本方法对四环素、金霉素、土霉素、强力霉素检测限均为50μg/kg)，检测结果如表2所示。
表2的检测结果显示，胶体金试纸条对四环素类药物的检测限最低，时间分辨荧光试纸条次之，但均高于仪器检测法，均符合我国、欧盟和日本对四环素类药物残留的相关规定。
3 讨论
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本试验成功开发了一种动物源食品中四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析快速检测试纸条，采用本试纸条对不同动物源性食品中四环素类药物残留检测的精密度、检测限、特异性和稳定性等性能指标进行了探讨，同时将本试验研发的检测方法同已有的胶体金和仪器检测方法进行了比较，结果显示，本试验研发的试纸条检测限高于胶体金、低于仪器检测法。但是，同胶体金试纸条相比，本试验研发的四环素类药物时间分辨荧光免疫层析快速检测试纸条制备过程中需要的原材料少，尤其是对抗原和抗体的需求量远少于胶体金试纸条，制作成本低。此外，由于本试纸条采用荧光微球模式，其染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，检测结果不受猪肉、鸡肉等组织检测样中杂质的影响，有效提高了检测结果的准确性和稳定性。
综上，本试验研发的四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析快速检测试纸条可用于四环素类多种药物的同时检测，其准确性和可靠性均可满足我国、欧盟和日本对四环素类药物的检测技术的要求。同时，该方法具有检测灵敏度高、操作简便、稳定性好、生成成本低等优点，可用于不同动物食源性食品中四环素类药物的快速检测分析，应用前景广阔。, http://www.100md.com(万宇平 崔海峰 王兆芹 宋灏 丛倩千)
1.3.3 样品前处理
准确称取1g±0.01g组织样品至10mL离心管中，加入3mL样本提取液，涡动2min充分混匀后，3000r/min离心5min后取上清(若上层有漂浮物则拨开取上清)待检。
1.3.4 检测过程
用微量移液器准确吸取100μL待检样品溶液于微孔中，小心抽吸至充分与微孔中试剂混匀，室温(20～25℃)作用3min;吸取孔内混合液全部量(约100μL)垂直滴加于试纸卡加样孔(S孔)中，液体流动时开始计时，室温反应5min;用时间分辨荧光免疫分析仪或紫外光下肉眼判读结果。
1.3.5 检测结果分析
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阴性(-)：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阴性，或紫外灯下肉眼观察T线亮度比C线亮度亮一半以上，则表示样本中不含有四环素类药物或其浓度低于检测限。
阳性(+)：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阳性，或紫外灯下肉眼观察T线亮度比C线亮度暗一半以上，则表示样本中四环素类药物浓度等于或高于检测限。
无效：若质控区未检出荧光信号强度，表明操作过程不正确或试纸卡已失效。
2 结果与分析
2.1 精密度试验
向猪肉组织中分别加入1/2、1、2倍检测限浓度的四环素类药物，以未加入四环素类药物的猪肉组织为空白对照，每组检测10次。
同一添加浓度下，平行检测样的检测结果相同，同时检测线亮度保持一致。通过荧光检测仪对T、C线的亮度进行读数，计算试纸条的变异系数小于6%，说明本试验研发的四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析快速检测试纸条检测性能稳定，精密度高。
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2.2 检测限试验
向空白猪肉、鸡肉样品中分别添加四环素类药物标准品至终浓度为：四环素15、30、45、60μg/kg，金霉素30、60、90、120μg/kg，土霉素20、40、60、80μg/kg，强力霉素40、80、120、160μg/kg，分别以未添加四环素类药物的猪肉、鸡肉组织为空白对照，用时间分辨荧光免疫层析试纸条进行检测验证。
随着四环素类药物浓度的增加，试纸条检测结果阴性越明显。当猪肉组织和鸡肉组织中四环素类药物的添加量为1倍，即四环素为30μg/kg、金霉素为60μg/kg、土霉素为40μg/kg、强力霉素为80μg/kg时，T线亮度为C线亮度的一半左右，结合读数仪的检测结果可以进一步印证，本试验研发的四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析快速检测试纸条对四环素、金霉素、土霉素和强力霉素的检测限分别为30μg/kg、60μg/kg、40μg/kg、80μg/kg。
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分别向猪肉组织中添加30μg/kg四环素(TC)、100μg/kg磺胺二甲基嘧啶(SM2)、恩诺沙星(ENR)、氯霉素(CAP)，以未添加任何药物的猪肉组织为空白对照，每个样品做2次平行试验。
当向检测样中添加30μg/kg四环素时，试纸条检测结果为阳性，而添加100μg/kg磺胺二甲基嘧啶、恩诺沙星、氯霉素等药物的检测样品检测结果均为阴性，即本试纸条对磺胺二甲基嘧啶、恩诺沙星、氯霉素等药物无交叉反应，特异性好。
2.4 稳定性试验
将试纸条分别置于4℃和37℃下14d与28d，相同情况下检测加入30μg/kg四环素的猪肉组织和鸡肉组织样品中，以未经过处理的试纸条检测值为空白对照，每个样品做3次平行试验，分别采用肉眼判断和读数仪对检测结果进行测定，用于检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条稳定性，结果如表1所示。
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从表1可以看出，本试验研发的四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析快速检测试纸条经高、低温处理后对四环素类药物的检测灵敏度没有发生显著变化，表明試纸条稳定性较强。
2.5 与其他检测方法的对比
分别用勤邦公司的四环素类药物检测胶体金试纸条、时间分辨荧光试纸条和仪器方法测定添加不同浓度四环素类药物的猪肉组织，仪器方法参考GB/T 21317-2007 《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》(本方法对四环素、金霉素、土霉素、强力霉素检测限均为50μg/kg)，检测结果如表2所示。
表2的检测结果显示，胶体金试纸条对四环素类药物的检测限最低，时间分辨荧光试纸条次之，但均高于仪器检测法，均符合我国、欧盟和日本对四环素类药物残留的相关规定。
3 讨论
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本试验成功开发了一种动物源食品中四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析快速检测试纸条，采用本试纸条对不同动物源性食品中四环素类药物残留检测的精密度、检测限、特异性和稳定性等性能指标进行了探讨，同时将本试验研发的检测方法同已有的胶体金和仪器检测方法进行了比较，结果显示，本试验研发的试纸条检测限高于胶体金、低于仪器检测法。但是，同胶体金试纸条相比，本试验研发的四环素类药物时间分辨荧光免疫层析快速检测试纸条制备过程中需要的原材料少，尤其是对抗原和抗体的需求量远少于胶体金试纸条，制作成本低。此外，由于本试纸条采用荧光微球模式，其染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，检测结果不受猪肉、鸡肉等组织检测样中杂质的影响，有效提高了检测结果的准确性和稳定性。
综上，本试验研发的四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析快速检测试纸条可用于四环素类多种药物的同时检测，其准确性和可靠性均可满足我国、欧盟和日本对四环素类药物的检测技术的要求。同时，该方法具有检测灵敏度高、操作简便、稳定性好、生成成本低等优点，可用于不同动物食源性食品中四环素类药物的快速检测分析，应用前景广阔。, http://www.100md.com(万宇平 崔海峰 王兆芹 宋灏 丛倩千)